婴幼儿配方乳粉中14 种季铵盐类消毒剂的测定

郑红，卢兰香，程志，于文江，宿书芳，孙立臻，刘艳明

（山东省食品药品检验研究院，山东省特殊医学用途配方食品质量控制工程技术研究中心，济南 250101）

0 引言

季铵盐类消毒剂是一类广谱高效消毒剂，常用于畜舍、挤奶和盛奶容器的消毒，有报道指出此类消毒剂通过接触迁移污染原料奶，进而引起人类哮喘、皮肤过敏和视力减退等病症，带来潜在的食品安全风险[1]，因此建立季铵盐类消毒剂的检测方法尤为重要。

目前关于季铵盐类消毒剂的检测方法主要有毛细管电泳法[2]、离子色谱法[3]、液相色谱法[4-10]、气相色谱-质谱法[11-12]和液相色谱-质谱法[13-16]。前处理方法有直接提取法[17-18]、离子交换柱净化法[19]和QuEChERS 净化方法[20-22]。盐析辅助均相液液萃取是一类相转变分离技术，具有快速、操作简单优点。本文拟基于盐析辅助均相液液萃取和液质联用技术建立一种测定婴幼儿配方乳粉中14 种季铵盐类消毒剂残留的方法。为食品安全风险预警提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

十二烷基二甲基苄基氯化铵、十四烷基二甲基苄基氯化铵、十六烷基二甲基苄基氯化铵、十八烷基二甲基苄基氯化铵、双十烷基二甲基溴化铵、双十二烷基二甲基溴化铵、双十四烷基二甲基溴化铵、双十六烷基二甲基溴化铵、双十八烷基二甲基溴化铵、苄索氯铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、四丁基硫酸氢铵（纯度均不小于98%）购于日本TCI 公司。甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯）和乙酸铵（色谱纯）购自德国Merck公司；无水硫酸镁（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪配Shimadzu LC-30A 高效液相色谱仪、himadzu LCMS-8050 串联四极杆质谱仪，日本岛津公司；BT 125D 电子天平，德国Sartorius 公司；MS3 型涡旋混合器，德国IKA 公司；SB-800DTD 超声清洗仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；Mili-Q 超纯水机，美国Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

标准储备溶液：分别准确称取14 种季铵盐类标准物质各10.0 mg（精确至0.01 mg）于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，分别配制成浓度为1.0 mg/mL 的标准储备溶液，4 ℃避光冷藏保存。

混合标准中间溶液：准确移取100 μL 的14 种标准储备溶液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配成质量浓度为10 μg/mL 混合标准溶液，4 ℃冷藏保存。

基质标准溶液制备：用1.3.3 处理后的空白样品提取液将混合标准中间溶液配制成适当浓度的基质混合标准工作溶液。

1.3.2 仪器条件1.3.2.1 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI 源）；采集模式：正离子模式；监测方式：多反应监测（MRM）；雾化气流量为1.5 L/min；干燥气流量为5.0 L/min；加热气流量为10.0 L/min；接口温度为300 ℃；加热块温度为500 ℃；CID 气压力为17 kPa。质谱/质谱测定参考条件如表1 所示。

表1 14 种消毒剂的质谱参数

(续表1)

1.3.2.2 色谱条件

色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（75 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A：0.1%甲酸甲醇（含浓度10 mmol/L 乙酸铵）；流动相B：0.1%甲酸水（含浓度10 mmol/L 乙酸铵）；流速0.3 mL/min，进样体积为1 μL；柱温40 ℃；洗脱方式：梯度洗脱如表2 所示。

表2 超高效液相色谱串联质谱的流动相及梯度洗脱条件

1.3.3 样品前处理

称取1 g（精确至0.01 g）婴幼儿配方乳粉于50 mL离心管中，加入2 mL 水溶液，涡旋混匀1 min，超声15 min，加入8 mL 乙腈，涡旋混匀1 min，超声15 min，加入2 g 无水硫酸镁，震荡30 min，转速为8000 r/min离心5 min，取全部上清液至15 mL 离心管中，50 ℃氮吹浓缩至干，准确加入0.5 mL 甲醇溶解残渣，经0.22 μm 有机微孔滤膜过滤后进样测定。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 水量的优化

婴幼儿配方食品多是以乳基为主的固体食品，需要先用水将其溶解，再提取目标化合物。对此我们考察了试样质量和水体积的比例（1∶1，1∶2，1∶5），发现1∶1 时有些样品不能完全溶解，而当比例为1∶5 时，在后续的净化过程中，双十八烷基二甲基溴化铵回收率低至3%，而采用1∶2 的比例时，样品不仅能完全溶解，而且回收率提高至80%以上。故最终选择1∶2 的比例。

2.1.2 盐析辅助均相液液萃取(SHLLE)的优化

SHLLE 在QuEChERS 前处理技术中应用广泛，其关键因素是在盐析条件下，目标物在水相和有机相（萃取剂）中的分配效率。本研究考察了不同的萃取剂（10%甲酸乙腈、乙腈、10%氨水乙腈）对14 种消毒剂的提取效率及基质效应的影响。如图1 ，结果表明，不同的萃取剂对碳链相对短的化合物的提取效率几乎无差别，但对于长链双烷基季铵盐差异较大。在碱性萃取剂下，当双烷基季铵盐碳链增加时回收率明显降低，如双十二烷基二甲基溴化铵、双十四烷基二甲基溴化铵、双十六烷基二甲基溴化铵、双十八烷基二甲基溴化铵的回收率分别为91%，77%，59%，20%，而酸性和中性萃取剂下回收率较好。

图1 14 种消毒剂在3 种萃取剂下的盐析萃取回收率

液相色谱串联质谱仪器虽然具有液相优异的分离度和质谱较高的分辨力，但基质效应的存在经常影响定量的准确性和精密度。本文采取提取后添加法对基质效应进行评价[36]，测定纯溶剂与空白基质提取液中相同浓度水平下分析物的质谱响应强度，通过ME=B/A×100%公式计算得到二者相对比值来评价基质效应。其中，ME 表示基质效应的大小，A 为纯溶剂标准溶液的峰面积，B 为基质匹配标准溶液的峰面积。ME 大于100%时为基质增强效应，小于100%时为基质抑制效应，设置以80%～120%为基质效应可忽略。此种评价方式不仅可以对基质效应进行定量评价，而且可以比较不同方法的基质效应大小。为了考察不同萃取剂对14 种消毒剂的基质效应，用1.3.3 的前处理步骤制备的空白基质溶液和定容溶剂分别稀释14 种目标化合物，得到相同浓度的测定液，采用相同的HPLC-MS/MS 方法测定，计算各自的峰面积。按照公式ME=B/A×100%计算。本文采用此评价方法考察了3 种萃取剂对14 种季铵盐类消毒剂的基质效应，结果见图2，在酸性萃取剂下十六烷基三甲基溴化铵（56%）、双十六烷基二甲基溴化铵（78%）和双十八烷基二甲基溴化铵（54%）三种消毒剂不在此范围内；而在中性和碱性萃取剂下只有双十八烷基二甲基溴化铵的基质效应不在此范围内。从提取效率及基质效应综合考察，最后选择乙腈作为最终的萃取剂。

图2 14 种消毒剂在3 种萃取剂下的基质效应

2.2 液相色谱条件优化

选用实验室常用的C18 色谱柱分析，由于季铵盐类消毒剂多为长链烷基化合物，在C18 色谱柱上保留较强，而初始比例为80%有机相时，发现四丁基硫酸氢铵保留弱（保留时间不到1 min），当调至50%有机相时在1.5 min 后出峰，而对于保留较强的双十八烷基二甲基溴化铵，需要100%有机相至少洗脱3 min 才可完全洗脱。为了洗脱掉更多杂质而不影响后续的分析测定，最终采用100%有机相洗脱5 min。

本文首先尝试以甲醇-水溶液、甲醇-10 mmol/L乙酸铵水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水（含10 mmol/L 乙酸铵）溶液实验，结果发现除双十四烷基二甲基溴化铵、双十六烷基二甲基溴化铵、双十八烷基二甲基溴化铵外，采用甲醇-0.1%甲酸水（含10 mmol/L 乙酸铵）溶液作为流动相时，峰形最好、响应值较高。当有机相中添加0.1%甲酸（含10 mmol/L 乙酸铵时，需在100%有机相下才被洗脱的以上3 种极性较弱的化合物的峰形及响应值才大幅提高，最终洗脱条件见表2，总离子流图见图3。

图3 14 种消毒剂的总离子流(质量浓度5 ng/mL)

2.3 质谱条件优化

季铵盐类消毒剂是通过带正电的氮原子链接4个官能团的（R4N+）化合物，常与Cl，Br 等卤族阴离子以盐的形式存在。首先采用全扫描的模式，对化合物进行全扫描，发现母离子都是失去卤离子的R4N+离子；然后通过调节碰撞能对子离子进行扫描，发现相同结构的季铵盐具有类似的碎片离子，3 种典型季铵盐类消毒剂裂解图及二级质谱图见图4。如烷基二甲基苄基铵盐都有苄基碎片（C6H5-CH2+，m/z= 91）、双链烷基二甲基铵盐和烷基三甲基铵盐两类盐先是氮原子与长链烷基σ 键断裂，形成[M-R+H]+离子和烷基自由基，然后烷基自由基经过半异裂形成CnH2n+1系列峰簇，其中以C4H9+，m/z=57,响应最高，其中烷基三甲基铵盐的[M-R+H]+离子为(CH3）3NH+, m/z= 60）特征碎片。

图4 3 类季铵盐类消毒剂的代表性裂解图及二级质谱

2.4 方法的线性范围、检出限与定量限

将1.3.1 基质标准溶液按浓度从低到高依次经液相色谱-串联质谱测定，以目标物定量离子的峰面积对浓度作标准曲线，14 种季铵盐类消毒剂在2～200 ng /mL浓度范围内，各化合物相关系数均大于0.99，线性关系良好,见表3。

表3 14 种季铵盐类消毒剂的线性回归方程方程和相关系数

采用在空白样品中添加目标化合物的方法确定方法定量限，以对应色谱峰响应值3 倍信噪比的质量浓度作为方法检出限，为0.5 μg/kg；以对应色谱峰响应值10 倍信噪比的质量浓度作为方法定量限，为1.0 μg/kg。

2.5 方法回收率和精密度

称取空白婴幼儿配方奶粉分别加入低、中、高3 水平浓度为1 、5 μg/kg 和50 μg/kg 的加标样品，每一浓度平行测定6 次，按照本方法处理测定得到回收率及精密度，测定结果均具有良好的回收率及重现性，测定结果见表4。

表4 婴幼儿配方奶粉中14 种季铵盐类消毒剂的回收率与精密度(n=6)

2.6 样品测定

对市售的10 个生产企业的30 个婴幼儿配方奶粉进行测定，发现十二烷基二甲基苄基氯化铵检出率为27%，检出值为1.5 ～80.0 μg/kg；十四烷基二甲基苄基氯化铵检出率为33%，检出值为1.3～61.1 μg/kg；十六烷基二甲基苄基氯化铵检出率为23%，检出值为1.1～5.6 μg/kg，其他未有检出。但都未超过欧盟规定的上限值0.1 mg/kg。表5 结果表明，婴幼儿配方奶粉中确实存在季铵盐类消毒剂残留，应当引起相关监管部门及生产企业的高度重视，完善相关的检测及限量标准。

表5 实际样品中14 种季铵盐类消毒剂的检测结果 μg/kg

(续表5)

3 结论

本文建立了以盐析辅助均相液液萃取技术为基础，同时测定婴幼儿配方乳粉中14 种季铵类消毒剂的液相色谱-串联质谱方法。本方法操作简单、快捷、通量大，并对其进行方法学验证及实际样品应用，结果表明，本方法准确度高，精密度好，基质效应低，适用于婴幼儿配方乳粉中14 种季铵类消毒剂残留的测定。不仅为建立相关检验及限量标准提供参考，而且为企业及相关监督管理部门的风险监控提供有力的技术支撑。