过氧乙酸协同次氯酸钠对植物乳杆菌噬菌体的复合灭活效果

郭蛇，李伟娜，马瑞瑞，朱含芳，陈霞

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室农业农村部奶制品加工重点实验室内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室，呼和浩特 010018）

0 引言

植物乳杆菌是定殖人体肠道的原籍菌，拥有降低胆固醇，调节肠道菌群紊乱等多种益生功效[1-3]。该菌株常被用在发酵制品中发挥其益生作用。然而，在发酵过程中，噬菌体污染是导致产品发酵失败的主要原因之一。目前，乳制品加工行业常用的杀菌措施是使用化学杀菌剂进行处理。在工厂中使用的化学杀菌剂必须符合浓度低、残留量少、对人体无害的标准，需要通过特定的杀菌测试才被允许使用[4-5]。过氧乙酸是一种绿色且分解产物无毒的化学杀菌剂，但其单独使用时，对真菌或病毒的灭活效果并不显著[6-7]。近年来将化学杀菌剂复配使用已成为一个研究热点，大量研究表明，化学杀菌剂复配使用可提高对微生物的灭活效果，降低其不良作用[8]。

噬菌体P1、P2 均分离自植物乳杆菌IMAU10120异常发酵液，前期研究表明单独使用0.45%过氧乙酸处理60 min 仍不能使这两株噬菌体完全灭活[9-10]。因此，本研究将过氧乙酸与其他化学杀菌剂复配使用，评估常见化学消毒剂复配对噬菌体的灭活效果，为工业生产中噬菌体防治措施的建立提供一定的数据支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及噬菌体

宿主菌植物乳杆菌IMAU10120 及噬菌体P1、P2均保藏于内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室。

1.1.2 主要实验仪器与设备

UV-1700 紫外可见分光光度计，日本岛津株式会社分析仪器部；DHP-9272 电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；SX-500 高压蒸汽灭菌锅，日本Tomy Digital Biology；DL-CJ-2F 超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；EP pendorf 5810R 台式高速冷冻离心机，德国Hambury 公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化

将宿主菌植物乳杆菌IMAU10120 以2%接种量接种于5 mL MRS 液体培养基中，37 ℃静置培养24 h，连续3 天传代活化，置于4 ℃冰箱备用。

1.2.2 噬菌体增殖

将活化3 代的宿主菌IMAU10120 以2%的接种量接入5 mL MRS 液体培养基中，置于37 ℃培养至OD600约为0.5 时，按感染复数5 加入噬菌体裂解液，加入CaCl2至终浓度为10 mmol/L，充分混匀后置于37 ℃培养3～4h 至菌液清澈，将其移入灭菌后的离心管中，8000 rpm 离心5 min，用0.22 μm 的滤菌膜过滤，置于4 ℃保存备用。采用双层平板法对噬菌体效价进行测定。

1.2.3 过氧乙酸协同次氯酸钠对植物乳杆菌的灭活效果

（1）过氧乙酸与次氯酸钠直接混合对宿主菌的灭活效果。将2.25 mL 不同浓度次氯酸钠与2.25 mL 0.3%（质量分数）过氧乙酸溶液直接混合后，摇匀，加入500 μL 的宿主菌混匀，室温培养10 min，采用平板活菌计数法计数，37 ℃恒温培养48 h 计算其活菌数。

（2）过氧乙酸与次氯酸钠依次处理对宿主菌的灭活效果。将0.3%过氧乙酸溶液分装2.25 mL 于试管中，加入500 μL 宿主菌混匀，室温培养5 min 后，再加入2.25 mL 不同浓度次氯酸钠溶液，混合摇匀，继续培养5 min 后取出，采用平板活菌计数法计数，37 ℃恒温培养48 h 计算其活菌数。

（3）次氯酸钠与过氧乙酸依次处理对宿主菌的灭活效果。将不同浓度次氯酸钠溶液分装2.25 mL 于试管中，加入500 μL 宿主菌混匀后，室温培养5 min 后，加入2.25 mL 0.3%过氧乙酸溶液，混合均匀，继续培养5 min 后取出，采用平板活菌计数法计数，37 ℃恒温培养48 h 计算其活菌数。

（4）对照实验。将0.3%过氧乙酸及不同浓度次氯酸钠溶液分装4.5 mL 于试管，接入500 μL 的宿主菌，混合均匀后室温培养10 min，采用平板活菌计数法计数，37 ℃恒温培养48 h 计算其活菌数。

1.2.4 过氧乙酸协同次氯酸钠对噬菌体的灭活效果

（1）过氧乙酸与次氯酸钠直接混合对噬菌体的灭活效果。将450 μL 不同浓度次氯酸钠溶液与450 μL 0.3%过氧乙酸溶液直接混合后分装于1.5 mL 的EP 管中，摇匀后加入100 μL 噬菌体混匀，室温培养10 min，10 倍梯度稀释后采用双层平板法对处理后的噬菌体计数（计数过程控制在3 min 内完成），37 ℃培养24 h，计算其灭活效果。

（2）过氧乙酸与次氯酸钠依次处理对宿主菌的灭活效果。将0.3%过氧乙酸溶液分装450 μL 于1.5 mL的EP 管中，分别加入100 μL 噬菌体裂解液混匀，室温培养5 min 后，分别加入450 μL 不同浓度次氯酸钠溶液，混合摇匀，继续培养5 min 取出，10 倍梯度稀释后采用双层平板法对处理后的噬菌体计数（计数过程控制在3 min 内完成），37 ℃培养24 h，计算其灭活效果。

（3）次氯酸钠与过氧乙酸依次处理对宿主菌的灭活效果。将不同浓度次氯酸钠溶液分装450 μL 于1.5 mL EP 管中，分别加入100 μL 噬菌体裂解液后充分混匀，室温培养5 min 后，分别加入0.3%过氧乙酸溶液，混合均匀，继续培养5 min 后取出，10 倍梯度稀释后采用双层平板法对处理后的噬菌体计数，37 ℃培养24 h，计算其灭活效果。

（4）对照实验。将不同浓度次氯酸钠溶液分装900 μL 于1.5 mL 的EP 管中，并加入100 μL 的噬菌体裂解液，混匀，室温培养10 min 后，10 倍梯度稀释后采用双层平板法对处理后的噬菌体进行计数（计数过程需在3 min 内完成），37 ℃培养24 h，计算灭活效果。

1.2.5 数据统计与分析

以单一化学试剂处理的噬菌体裂解液作为对照，所有独立试验均进行3 次平行试验。数据均采用Origin 2018 软件作图分析。使用SPSS 软件(IBM Corp., Armonk, NY)，采用单向方差分析，比较数据间显著性差异（p< 0.05）。

2 结果与分析

2.1 过氧乙酸与次氯酸钠复合处理对植物乳杆菌IMAU10120 的灭活效果

过氧乙酸具有强氧化性及易挥发的特性，食品工业中常使用的灭菌浓度为0.2%～0.5%，其通过破坏细胞膜，氧化蛋白质，损伤核酸等方式使微生物灭活[11-12]。对照试验表明，0.3%过氧乙酸单独处理植物乳杆菌10 min后，植物乳杆菌的存活率为10.06%。0.3%过氧乙酸与不同浓度次氯酸钠复配处理植物乳杆菌IMAU10120 的灭菌效果如图1 所示。

图1 0.3%过氧乙酸与不同浓度次氯酸钠溶液复合处理植物乳杆菌的存活率

由图1 可知，单独使用次氯酸钠处理宿主菌，随着次氯酸钠浓度增加，植物乳杆菌IMAU10120 的存活率显著降低（p＜0.05）。次氯酸钠浓度为800 mg/kg时，先加次氯酸钠处理5 min 后，再加0.3%过氧乙酸处理5 min 对宿主菌的灭菌效果最强，宿主菌的存活率为0.38%。当次氯酸钠浓度为400 mg/kg 时，除直接混合处理方式，其余复合灭活效果均优于对照组。当次氯酸钠浓度为100 mg/kg、200 mg/kg 时，次氯酸钠处理5 min 后，再加0.3%过氧乙酸处理5 min 的灭活效果较同浓度的其他处理方式好，宿主菌的存活率分别为12.21%，12.16%。

2.2 过氧乙酸与次氯酸钠复合处理对噬菌体P1 的灭活效果

噬菌体P1 的初始效价为8.16 lg PFU/mL。单独使用0.3%过氧乙酸处理10 min 噬菌体P1 后，其效价下降1.05 个对数级，灭活效果有限，故评价0.3%过氧乙酸与不同浓度次氯酸钠复合使用后对噬菌体灭活效果的影响有积极意义。0.3%过氧乙酸和不同浓度次氯酸钠复合处理对噬菌体P1 的灭活结果如表1 所示。

表1 0.3%过氧乙酸与不同浓度次氯酸钠复合处理噬菌体P1 的存活数 lg PFU/mL

由表1 可知，当次氯酸钠浓度为100 mg/kg 时，3种复合处理方式对噬菌体P1 的灭活效果均优于对照组，其中先加次氯酸钠处理5 min 后，加0.3%过氧乙酸再处理5 min 对噬菌体P1 的灭活效果最佳，与对照组相比下降了1.79 个对数级；当次氯酸钠的浓度为200 mg/kg时，先加次氯酸钠处理5 min 后，再加0.3%过氧乙酸处理5 min 与先加0.3%过氧乙酸处理5 min，再加次氯酸钠处理5 min 对噬菌体P1 的灭活效果无显著性差异（p＞0.05）；当次氯酸钠浓度为400 mg/kg 时，除先加0.3%过氧乙酸处理5 min 后，再加入次氯酸钠处理5 min噬菌体的灭活效果较对照组差，其余复合灭活效果都优于对照组。推测灭活效果较对照组差的原因可能是，添加过氧乙酸溶液后再加次氯酸钠溶液，使次氯酸分解浓度增加，有效氯浓度减少，影响灭活效果[13]。当次氯酸钠浓度为800 mg/kg 时，直接混合的灭活效果最佳，处理10 min后可使噬菌体P1 完全失活。

2.3 过氧乙酸与次氯酸钠复合处理对噬菌体P2 的灭活效果

噬菌体P2 的初始效价为8.77 lg PFU/mL。单独使用0.3%过氧乙酸处理10 min 噬菌体P2 后，噬菌体P2的存活率为55.83%，仅使其下降1.11 个对数级。表2 为0.3%过氧乙酸与不同浓度次氯酸钠复合处理噬菌体P2的灭活效果。

表2 0.3%过氧乙酸与不同浓度次氯酸钠复合处理噬菌体P2 的的存活数 lg PFU/mL

由表2 可知，同一处理方式，随着次氯酸钠的浓度升高，对噬菌体P2 的灭活作用增强。同一浓度不同处理方式的灭活效果存在显著差异（p<0.05）。当次氯酸钠浓度为100 和200 mg/kg 时，直接灭活的噬菌体P2 效价显著低于其他灭活方式（p<0.05），并且相较单一灭活的效价分别降低0.24 和0.49 个对数级，与其他浓度相比，低浓度（100 mg/kg 和200 mg/kg）次氯酸钠对噬菌体P2 的灭活效果较弱；而当次氯酸钠浓度为400 和800 mg/kg 时，先加次氯酸钠处理5 min 后，加入过氧乙酸处理5 min 对噬菌体P2 显示出最佳的灭活效果，噬菌体P2 效价较单一灭活分别降低了1.16 和0.91 个对数级。综合以上结果，表明次氯酸钠的浓度及使用顺序对噬菌体P2 的灭活效果有影响。

3 讨 论

在乳制品和肉制品的发酵生产中，噬菌体侵染是导致发酵失败的最常见原因，这不仅会给工厂造成经济损失，还可能导致食源性疾病。因此，研究控制噬菌体侵染的方法，尤其是在开发包括功能性食品在内的新型发酵产品方面显得尤为重要。使用单一化学杀菌剂对噬菌体进行灭活是目前工业上普遍采用的限制噬菌体侵染的重要措施，但是单一化学杀菌剂的使用对一些噬菌体灭活效果并不理想。有研究表明，将不同化学杀菌剂进行复配使用，可增加其对噬菌体的灭活效果。过氧乙酸在消毒剂中占有重要的地位，具有广谱的杀菌能力，是应用较广的消毒剂之一[14]，可作为复配的化学杀菌剂使用。

含氯消毒剂可溶于水产生次氯酸类消毒剂，次氯酸分子量小，能较好的吸附和穿透微生物细胞壁，进入细胞内部，直接氧化微生物细胞内含硫基的丙氨酸、色氨酸等，从而控制微生物蛋白质的合成以导致微生物死亡[15]。2002年，Suárez 等的研究结果显示，100 mg/kg次氯酸钠可使乳球菌噬菌体001 和QF12 在5 min 内完全灭活。噬菌体046 和QP4 经100 mg/kg 次氯酸钠处理后，T99值分别为32.7 和8.8 min，300 mg/kg 和200 mg/kg的次氯酸钠可使它们分别在45 min、30 min 后表现出完全失活[16]。由此可知，次氯酸钠可有效灭活上述乳球菌噬菌体。2009年，Marcó 等研究发现，800 mg/kg 次氯酸钠对噬菌体活力的影响最大，15 min 时可使植物乳杆菌噬菌体B2 完全失活，30 min 时可使噬菌体B1、FAGK1、FAGK2 完全失活。400 mg/kg 的次氯酸钠效果略差，5 min 内使4 种噬菌体达到99%灭活；200 mg/kg 的次氯酸钠对噬菌体灭活效果不佳，达到99%灭活的时间均大于45 min[17]。由此可知，用低浓度次氯酸钠单独对噬菌体进行灭活，可能由于其对蛋白酶活性的影响力较差，从而导致灭活效果不显著，随着次氯酸钠浓度增加对噬菌体灭活效果越好，但具体失活所用的时间主要取决于噬菌体特性。本团队前期的研究结果显示，当次氯酸钠的浓度为800 mg/kg时，可在60 min 使噬菌体P1 完全灭活[10]；当次氯酸浓度为800 mg/kg 时，在30 min 使噬菌体P2 完全失活[18]。而在本实验中，800 mg/kg 次氯酸钠与0.3%过氧乙酸直接混合处理10 min 可使噬菌体P1 完全灭活，由此可知该种处理方式可有效提高噬菌体P1 的灭活效果。对于噬菌体P2，依次使用800 mg/kg 次氯酸钠和过氧乙酸处理5 min，虽未使其完全失活，但仍使其效价下降5.05 个对数级。Marcó 和本实验研究结果可知，噬菌体的分离源和宿主菌相同，但其对次氯酸钠的耐受能力存在差异。

植物乳杆菌烈性噬菌体P1、P2 均分离自L.plantarum IMAU10120 的异常发酵液，两株噬菌体具有高度同源性，但在尾部纤维蛋白、假定蛋白方面存在差异。Maillard 等认为次氯酸钠可能通过尾蛋白的聚集导致噬菌体失活，或者可能导致其衣壳的结构改变，可能将核酸释放到周围的介质中，从而导致噬菌体失活[19]。上述实验结果显示P1 对次氯酸钠的耐受力低于P2，所以我们推测尾部纤维蛋白是导致耐受差异的主要原因。

4 结论

实验结果表明，依次使用800 mg/kg 次氯酸钠和0.3%过氧乙酸处理植物乳杆菌5 min 后，菌株存活率为0.38%；0.3%过氧乙酸与800 mg/kg 次氯酸钠直接混合可使噬菌体P1 在10 min 内完全失活；依次使用800 mg/kg 次氯酸钠和过氧乙酸处理5 min 后，可噬菌体P2 下降5.05 个对数级。说明过氧乙酸可以有效提高次氯酸钠的灭活效果。