乳中骨桥蛋白的研究进展

张雪丹，王祎，刘宗尚，于景华

（1.天津科技大学食品科学与工程学院 天津 300457；2.上海芝然乳品科技有限公司 上海 201404）

0 引言

骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）是一种带负电荷、高磷酸化和糖基化的蛋白质，等电点为3.6[1-2]。OPN含有一个RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp）序列，最初被鉴定为一种由成骨细胞产生的唾液蛋白[3]。目前OPN 已经被证明存在于乳液、胆汁、尿液等多数细胞和组织中，以分泌型OPN（sOPN） 和细胞内OPN（iOPN） 两种形式存在[4]。OPN 参与人体多种生理和病理过程，如骨重塑、伤口愈合、免疫调节等[5]。

OPN 在母乳中的平均浓度（138 mg/L）远高于牛乳（18 mg/L）[6]。但牛乳OPN 与人乳OPN 有61%的序列同源性，都包含相似的整合素结合、蛋白水解和PTM 位点[7]。此外，研究表明补充OPN 可以使配方奶粉喂养的婴儿在各方面更接近于母乳喂养婴儿[8]。本文综述了OPN 的结构、乳中OPN 的质量浓度及其影响因素、分离纯化和定量检测方法，并对OPN 的生物学功能以及OPN 在婴儿配方奶粉应用及展望作一阐述。

1 OPN 的结构特性

OPN 属于小整合素结合配体N 端联结糖蛋白家族，存在于人体人类4 号染色体（4q13）上[1]，由一个基因编码，合成时分子量约为32 ku，由于选择性剪接和不同翻译后修饰，其分子量范围在41～75 ku[9]。OPN属于本质无序蛋白，缺乏复杂的二级和三级结构[10]，由314 个氨基酸残基组成，由于牛乳OPN 缺乏与人OPN 中第188～209 对应的22 个残基序列，因此牛乳OPN 只含有262 个氨基酸，但与人乳OPN 中298 个氨基酸相比，仍有61%的序列同源性，另外还有44 个残基保持了很高的结构相似性[11]。此外，OPN 在乳中高度磷酸化，人乳OPN 与牛乳OPN 有部分相同的磷酸化位点以及相同的整合素结合序列[12]，在靠近RGD序列的非磷酸化区域都含有O-糖基化苏氨酸，但二者之间的聚糖结构存在显著的差异[13]。

牛乳OPN 和人乳OPN 的分子结构主要包括一个RGD 序列，2 个肝素结合位点，一个凝血酶裂解位点和一个钙结合位点[14]，如图1 所示。其中RGD 序列高度保守，具有促进细胞黏附蛋白质的作用，通过与αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α8β1 和α5β1 等整合素结合介导相互作用[15]。OPN 经凝血酶裂解后，暴露出可以与α4β1、α9β1 和α4β7 整合素结合的SVVYGLR 基序，促进细胞黏附[16]。此外，OPN 也是基质金属蛋白酶3 和7（MMP-3、7）的底物，与凝血酶裂解一样，碎片化的OPN 表现出增强的刺激细胞黏附和迁移的能力[17]。而钙结合位点在钙离子介导或参与的反应过程中发挥着重要作用[18]。OPN 还通过非RGD 结合位点和CD44 相互作用促进黏附和迁移[19]。OPN 含有两个端区，C 端与CD44 变体相互作用，还包含了两个肝素结合位点；而N 端包括整合素受体结合区[20]。OPN通过磷酸化、糖基化和蛋白水解处理进行翻译后修饰导致许多OPN 亚型的存在，目前已经鉴定的包括OPNa（全长亚型）、OPNb（缺少外显子5）、OPNc（缺少外显子4）[21]。由不同的细胞类型或者不同条件下表达的OPN 功能不同[22]。

图1 OPN 的结构特征[15]

2 OPN 的质量浓度及其影响因素

OPN 在大多数组织和体液中表达，但在乳腺中分泌最高质量浓度[23]。乳中OPN 的质量浓度受泌乳阶段、地域、物种、季节及疾病等因素的影响会产生变化。

2.1 泌乳阶段的影响

乳中OPN 的质量浓度在不同泌乳阶段存在差异。初乳中浓度最高，随泌乳期逐渐下降[23]。对1年哺乳期内母乳OPN 的浓度变化进行研究，发现母乳OPN在初乳（第1～7 d）质量浓度最高，约为178.0 mg/L，第9天时开始下降，并在哺乳一年内持续减少，降低至48.3 mg/L。这种变化可能是由于婴儿在不同的发育阶段需要不同数量的OPN 以满足不同的功能需求[24]。另一项对牛乳OPN 的研究也得出了相似的结论，结果表明牛初乳中OPN 的质量浓度较高（200 mg/L），在泌乳第5天，下降到低于其初始浓度的10%[25]。

2.2 地域的影响

乳OPN 的质量浓度存在地域差异性。对4 个不同国家母乳样本中的OPN 浓度进行研究发现，中国母乳中OPN 质量浓度（266.2 mg/L）和OPN 与总蛋白的比例（2.7%）最高；韩国和日本母乳中OPN 质量浓度较低，分别为216.2 mg/L 和185.0 mg/L；而丹麦母乳样本中的OPN 水平明显低于其他3 个国家，只有99.7 mg/L。OPN 质量浓度在整个哺乳期都呈下降趋势，并且在不同国家之间差异显著，但地域对OPN浓度产生影响的原因还不清楚，可能环境和饮食等差异有关[26]。

2.3 物种、季节和疾病的影响

乳中OPN 的质量浓度也会受到物种、季节以及疾病等因素的影响。对牛、水牛、牦牛、绵羊和山羊奶中的OPN 质量浓度进行测定，证实了不同物种乳中OPN 质量浓度存在差异，其中牦牛乳中OPN 质量浓度最高，为76.8～78.6 mg/L，牛乳中的OPN 质量浓度为51.4～56.4 mg/L，水牛乳中为51.8～68.5 mg/L，绵羊乳、山羊乳中分别为29.8～41.0 mg/L 和12.7～44.3 mg/L[27]。Lu 等[28]的研究结果也表明，除了母乳中存在最高浓度以外，牦牛奶中OPN 的质量浓度较高，分别是牛奶和山羊奶的3.5 倍和5.5 倍左右，且牦牛OPN 与牛OPN 相同，与人OPN 有61%的同源性。对不同季节的牛和水牛中的乳清蛋白进行研究，发现牛乳中OPN 的质量浓度在冬季和夏季无显著变化；但在水牛乳中，冬季OPN 的质量浓度高于夏季；与冬季的牛乳相比，OPN 在冬季的水牛乳中具有较高的丰度[29]。另外，OPN 的质量浓度也与乳腺疾病相关。研究表明与正常牛乳相比，由金黄色葡萄球菌感染引起的乳腺炎乳中OPN 的表达上调[30]。但另一项研究发现，与健康的荷斯坦牛乳和水牛乳相比，OPN 在患有亚临床和临床乳腺炎的牛乳和水牛乳中的质量浓度均较低[31]。

2.4 其他影响因素

最新的研究发现，乳中OPN 质量浓度还与产妇教育程度、产妇年龄以及产次等因素相关[32]。研究者分别在产后1～5 d（初乳）、8～14 d（过渡乳）、1 个月（早成熟乳）和6 个月（成熟乳）收集来自中国3 个地区的母乳样本，测定了其中主要蛋白质的浓度变化。结果表明，在泌乳前6 个月，乳中总蛋白浓度呈下降趋势；OPN 质量浓度在初乳中最高（71.8 mg/100 mL），随着哺乳期逐渐下降；第一次分娩的母亲在产后第一个月乳中OPN 质量浓度较高；母亲产龄越大、受教育程度越高，其成熟乳中OPN 的质量浓度越高。这一结果可能是由于年龄产生的乳腺的变化，或是饮食上的差异导致蛋白质分泌的差异。而OPN 的质量浓度在这3个地区之间是否存在差异也有待研究。

3 OPN 的检测方法

3.1 OPN 的分离纯化及鉴定

乳中OPN 会通过相互作用力与一些功能蛋白发生结合[33]，因此，乳OPN 的分离纯化过程相对复杂，一般是将几种方法结合来提高蛋白纯度。分离纯化的方法一般包括离子交换色谱（IEC）、疏水相互作用色谱（HIC）、凝胶过滤、反相色谱（RPLC）以及透析等，其中离子交换法和疏水作用色谱是最常用的方法。离子交换色谱是利用蛋白质在一定条件下所带电荷的差异，与离子交换剂之间相互作用来实现分离的方法，包括阴离子、阳离子两种交换剂[34]。OPN 是一种带负电荷的蛋白质，因此在分离纯化过程中多使用阴离子交换色谱柱。而疏水作用色谱作为重要的蛋白质分离纯化的方法之一，也广泛用于OPN 的分离纯化，通常与离子交换色谱结合实现更高纯度的蛋白分离。

通常纯化后OPN 需要进行定性分析，鉴定方法通常包括免疫印迹法和N-末端氨基酸序列分析法。免疫印迹技术是灵敏度、特异性较高的一种蛋白质分离检测技术，过程包括SDS-PAGE 凝胶电泳分离出蛋白质，然后固定到硝酸纤维素等载体上，利用特异性抗体实现对目标蛋白的检测[35]。在此过程中可以通过蛋白分子量初步判定是否含有目的蛋白。另外可将目标蛋白质的N-末端氨基酸序列与已知的牛OPN氨基酸序列进行对比实现对目标蛋白的鉴定。

Azuma 等[33]采用两步阴离子交换色谱法从牛乳清中分离OPN。先通过DEAE - Sephacel 色谱柱在pH 5.0 下分离酸性乳清，第一步色谱得到的OPN 的纯度为85%，随后使用POROSRHQ 阴离子交换柱进行二次色谱，最终从1 L 乳清中提取出约11 mg 纯化的OPN。该方法是通过免疫印迹和N-末端氨基酸分析对蛋白进行鉴定，通过SDS-PAGE 检测到一个分子量约为60 ku 的单个蛋白条带，其N 端氨基酸序列为LPVKPT，这与已知的牛OPN 相同。

Bayless 等[36]利用离子交换和疏水色谱从牛乳中分离OPN。通过DEAE-Sephacel 柱和phenyl-Hepharose两个色谱柱后，从1 L 牛乳中得到约8 mg 纯化的OPN。SDS-PAGE 显示蛋白分子量在60 ku 附近，N 端氨基酸序列与已知的牛OPN 一致，鉴定了纯化后的蛋白质为OPN。同样的，LAN 等[37]将阴离子交换色谱和疏水相互作用色谱结合，从1 L 母乳中分离提取出大约9 mg OPN。并通过质谱分析法进行鉴定，发现OPN的蛋白纯度大于97%。还有研究先利用离子交换层析技术对OPN 进行第一步分离纯化，再经过两次疏水相互作用，通过透析后冻干得到纯化的OPN 组分。将分离产物进行SDS-PAGE 电泳得到分子量约为60 ku，初步判定组分中含有目的蛋白。再通过免疫印迹法进一步鉴定该蛋白为OPN。这种方法得到的OPN 蛋白纯度较高，并且更利于保留蛋白活性[38]。

除此疏水作用色谱以外，一些其它的分离纯化技术也与阴离子交换技术结合利用。Sorensen 等[39]先通过阴离子交换层析、去除酪蛋白、羟基磷灰石层析和负亲和层析这4 个步骤从母乳中分离纯化OPN 及其片段，再利用尺寸排除色谱和反相色谱将纯化后的OPN 进一步分离成不同的分子形式，并通过SDSPAGE 和氨基酸序列分析对纯化的OPN 进行了鉴定。最终从每600 mL 母乳中可以纯化大约2 mg 完整的OPN。

目前市场上已经有OPN 成品（Lacprodan OPN-10），是使用阴离子交换法从牛乳清中分离得到的。最终产物中含有约78%的蛋白质，其中95%是OPN，并含有灰分（最多9%）、水分（最多5.5%）以及不到1%的脂肪和乳糖[40]。并且这种方法分离的OPN-10 成品已经过安全性评价证明无遗传毒性和致畸性作用，耐受性良好，无不良反应[40]。

3.2 OPN 的定量

目前对乳中OPN 定量常用的分析技术有无胶筛分毛细管电泳法（NGSCE）、酶联免疫吸附法（ELISA）、反相高效液相色谱法（RP-HPLC）和液相色谱法-串联质谱法（LC-MS/MS）等。

赵京山等[41]利用非涂层毛细管，选用大分子聚乙二醇作为筛分介质，对分离条件进行优化后进行OPN 的测定。经验证得到OPN 质量浓度在0.079～2.5 g/L 范围内线性关系良好（R2为0.996），检出限为0.079 g/L，回收率大于95%，RSD < 5%。结果表明该方法检测速度快、进样量小，并且自动化程度高，适于检测微量蛋白质。无胶筛分毛细管电泳与传统的凝胶电泳相比，易于填充和冲出，减少蛋白质的吸附和抑制电渗流，并且可以根据实验目的选择不同的筛分介质，但在蛋白质实际测定过程中仍然存在如蛋白质吸附、分辨率低及其他复杂成分的干扰等问题[42]。

酶联免疫法前处理相对简单，具有高度的特异性和敏感性，不同乳蛋白的交叉反应影响小[43]。OPN 可以通过ELISA 来测定，目前已应用于人乳、牛乳、婴幼儿配方奶粉[6]及人体血浆[24]中的OPN 定量。虽然ELISA 已经被广泛应用，但是研究显示，不同的商业化ELISA 试剂盒测定的浓度存在差异，这可能是由于所使用抗体的交叉反应性、存在翻译后修饰等因素的影响，造成测定结果存在差异[16]。而且ELISA 耗时长并且成本很高，相比之下高效液相色谱法（HPLC）提供了更高的分辨率，可以实现更快速、可重复的分离，在工业中一般采用HPLC 以降低样品量和成本[44]。

Farid 等[45]建立了一种反相液相色谱法（RP-HPLC）来量化婴幼儿配方奶粉中的OPN。结果表明，该方法具有良好的线性（R2=0.999）、灵敏度（检出限为0.14 mg/L、定量限为0.41 mg/L）、精密度（RSD < 0.2%）以及回收率（99% ～102%），证明该方法能够简单、快速、准确的测定婴幼儿配方奶粉中的OPN。但这种方法可能会受到其它各种蛋白质的干扰。

将液相色谱和质谱结合在一起能够有效降低样品分析时的复杂性，可以提供更大的特异性、速度和分析物范围。由于复杂样品中蛋白质的理化性质无明显差异，不易于在液相色谱中实现分离，因此一般利用酶消化目的蛋白，产生更小的肽以利于色谱分离，而且质谱仪对肽比蛋白质更敏感[44]。Faria 等[16]建立了一种使用毛细血管微流LC-MS/MS 系统来量化人体血浆中OPN 的方法并进行验证。该方法采用免疫纯化将OPN 从血浆中分离出来，经过胰蛋白酶消化后获得的生物学相关特征肽GDSVVYGLR 来进行定量。结果表明在25～600 ng/mL 范围内具有良好的线性，并具有良好的准确性和精密度。Bei Hu 等[27]利用超高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）对不同种类哺乳动物乳中的OPN 进行定量。该方法中蛋白质经胰蛋白酶消化，选择OPN 特征肽进行二甲基标记，经纯化富集后进行UHPLC-MS/MS 分析。得出方法的检出限和定量限分别为0.5 mg/L 和2.0 mg/L。线性关系良好（R2≥0.998），回收率为103.7%～111.0%，相对标准偏差为1.8%～6.2%。这种方法测定的牛乳中的OPN 含量（51.4～56.4 mg/L）要远高于Schack 等[6]用ELISA 法测定的结果（18 mg/L）。造成两种方法结果差异的原因可能是OPN 的修饰或者裂解可能会影响ELISA 中抗原和抗体之间的结合，也可能是受到牛的品种和泌乳期差异的影响[27]。目前ELISA 是使用较广泛一种测定，但其测定结果存在多变性，相对而言HPLC- MS/MS 直接对特征肽进行分析，可能会成为更有效的测定方法。

4 OPN 的功能

OPN 通过不同的机制在人体不同部位发挥作用，其生物活性一般是通过与细胞表面受体如CD44和整合素的直接相互作用来实现的[2]，同时sOPN 存在的修饰亚型和iOPN 也使OPN 具有多向活性[3]。OPN在乳中存在的最高含量也说明其在乳中的重要性。

4.1 乳OPN 的功能

有研究表明，乳腺上皮细胞在怀孕和哺乳期过度表达OPN，通过在乳腺上皮中表达OPN 反义RNA的转基因小鼠，发现OPN 合成的抑制导致了怀孕的小鼠缺乏乳腺肺泡结构，β-酪蛋白和乳清酸性蛋白的合成急剧减少，并且泌乳不足，这表明OPN 参与了乳腺发育和分化[46]。OPN 对乳腺的重要性还体现在OPN 基因（SPP1）的遗传变异会影响产奶量和局部乳腺免疫[23]。OPN 是高度磷酸化的蛋白质，因此能够与钙离子结合并形成可溶性复合物，从而抑制乳中无定形磷酸钙的沉淀[47]。此外，在乳中OPN 会通过静电或亲和力相互作用与乳铁蛋白等一些功能蛋白发生结合，并可能作为这些免疫调节或抗菌蛋白到其作用位点的转运体，并保护它们免受蛋白水解，在作用位点OPN 与这些蛋白可以独立或可能协同发挥作用[33]。研究表明口服OPN可以抑制DSS 诱导的小鼠结肠炎[48]；同时OPN 也可能通过改变免疫反应来促进病原防御，可以抵御细菌、病毒等感染[7]；可以通过黏附在生物膜中细菌表面来抑制口腔生物膜进一步形成[49]；并通过调节巨噬细胞IL-12和IL-10 细胞因子的差异表达来诱导免疫反应[50]。还有研究表明从牛乳中纯化的OPN 在牛体外受精和胚胎发育中起着促进作用[51]。对于OPN 在乳中的生物学作用的相关机制和作用还需进一步研究。

4.2 OPN 的其他功能

OPN 在人体中广泛存在并通过不同的机制发挥不同的作用。OPN 可以调节骨组织中的生物矿化，在此过程的功能主要包括调节骨细胞黏附、调节破骨细胞功能和调节基质矿化，以此来降低骨折的风险；OPN 可以提高细胞活力，在伤口愈合中也发挥着重要的作用[14]。另外，OPN 可以抑制上皮组织中钙晶体的生长和聚集，在体内起着关键的肾保护作用[52]；也可以防止酒精引起的肝损伤[53]等。然而，研究表明OPN过度表达也存在一些负面影响，例如，OPN 的释放会增加肿瘤的生长和转移[54]；OPN 也与心血管疾病有关，如OPN 会增加动脉粥样硬化斑块的形成导致动脉钙化的风险，增加血管阻力，导致心力衰竭等心血管疾病[55]；此外OPN 释放量增加会诱导产生胰岛素抵抗[14]。因此OPN 目前被认为是几种癌症的预后和诊断的生物标记之一，通过OPN 水平可以检测冠状动脉疾病的存在和严重程度，而降低血浆OPN 浓度也可能在预防糖尿病并发症方面发挥重要作用。

5 应用与展望

近年来的研究表明，OPN 在早期生命发育中发挥重要作用，主要表现在免疫调节、肠道发育及神经系统发育等方面[12]。但在婴儿配方奶粉中OPN 质量浓度仅有9 mg/L[6]，因此，OPN 的潜在价值在于将其补充到婴幼儿配方奶粉中，通过模拟母乳成分，给婴幼儿提供近似于母乳的营养和保护作用。

L.o.nnerdal 等[56]将普通配方奶粉和添加了两种不同浓度OPN 的配方奶粉（分别添加65 mg/L 和130 mg/L OPN，其中OPN 水平相当于母乳中OPN 浓度的50%或100%）分别喂养婴儿（1～6 个月），并与母乳喂养婴儿进行比较。结果表明，与食用普通配方奶粉的婴儿相比，食用添加OPN 的配方奶粉的婴儿血清中促炎细胞因子TNF-a 的浓度显著降低；婴儿的患病天数明显减少；并且食用补充100%OPN 配方奶粉的婴儿血浆苏氨酸及支链氨基酸明显较低。结果说明OPN 参与调节了婴儿的免疫功能，使配方奶粉喂养的婴儿与母乳喂养的婴儿更相似。同样的，研究发现，母乳喂养婴儿和补充OPN 的配方奶粉喂养的婴儿，在4 个月和6 个月时血浆样本中OPN 水平要高于喂养常规配方奶粉婴儿，表明在婴儿配方奶粉中补充OPN 可能是通过增加内源性OPN 合成发挥其有益功能[24]。

对牛乳OPN 进行体外消化研究证明，含有整合素结合基序的生物活性OPN 片段能够抵抗胃消化，在到达体内肠道后存活下来，并通过整合素信号在肠道内发挥多效性功能[57]。因此，部分研究利用动物模型探讨补充OPN 的配方奶粉对婴幼儿肠道发育的影响。对新生恒河猴分别给予母乳、普通配方奶粉和添加了质量浓度125 mg/L OPN 配方奶粉喂养3 个月，提取空肠mRNA 并进行微阵列分析。结果发现普通配方奶粉喂养和母乳喂养的幼猴肠道中的基因表达存在差异，在配方中补充了OPN 后改变了这种差异表，使喂养OPN 配方组的空肠转录组基因与母乳喂养更加相似，而且不会对新生儿的生长产生不利影响[8]。这说明补充OPN 可以通过整合素诱导肠道基因表达，促进新生儿肠道健康。Ren 等[58]对早产的仔猪注射LPS，并连续5 d喂食补充OPN（质量浓度30 g/L）的配方奶粉，与普通配方相比，补充OPN 后降低了腹泻率，并刺激了肠上皮细胞的增殖，对早产仔猪的未成熟肠道发挥了适度的保护作用。这些结果都表明OPN 可以在婴幼儿肠道中直接发挥作用，与SU 等人[59]的研究结果一致，在经过胃肠道消化后的母乳和婴儿配方奶粉中都发现的一种来自OPN 的多肽。

因此，OPN 作为一种多功能蛋白质，将其添加至配方奶粉中可以促进婴幼儿的免疫保护和肠道发育，减小配方奶粉喂养与母乳喂养的婴儿之间的差异。除此以外，有研究表明OPN 在婴儿早期的脑发育、学习和记忆功能中发挥着积极的作用[60]。这是通过小鼠口服乳OPN 得到的结果，但也表明了在配方奶粉中补充OPN 另一个可能的潜在益处。而且除了单独发挥作用外，OPN 在乳中会与乳铁蛋白（LF）相互结合形成LFOPN 复合物，其体外消化的稳定性和对肠细胞增殖和分化的促进作用高于单个蛋白质，并能更有效地被肠道上皮细胞结合和吸收，并增强它们各自的生物活性[37]。这种生物活性表明若将OPN 以复合物形式加入婴儿配方奶粉中，可能比单个OPN 发挥更好的功效。

目前对OPN 在婴幼儿配方奶粉中的应用研究还较少，但离子交换色谱已经应用于牛乳OPN 的分离纯化，并且成品已被证明安全无毒性。酶联免疫法和液相色谱-质谱联用可能成为更广泛使用的含量测定的方法。此外，牦牛乳中含有较高浓度的OPN，这也可能作为母乳OPN 的另一个替代来源。补充OPN可以使配方奶粉具有更接近母乳的功能，同时，OPN与乳中其它成分之间协同可能会发挥更好的作用。然而对于乳OPN 的更多的功能、作用机制及其添加到婴幼儿配方奶粉中的安全性未来还需进一步研究。