基于HPLC-MS/MS 的羊乳寡糖GP 衍生化条件优化

张曦美，王海燕，王爽爽，李璐，杜管利，马宏祥，葛武鹏

（1. 西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2. 富平县检验检测中心 陕西省羊乳产品质量监督检验中心，陕西 富平 711700；3. 陕西秦龙乳业集团有限公司，西安 710000；4. 陕西红星美羚乳业股份有限公司，陕西 富平 711700）

0 引言

寡糖（Milk oligosaccharides, MOs）是由3～15 个单糖通过糖苷键连接而形成的直链或支链的低聚合体，主要由葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、岩藻糖（Fuc）、N-乙酰神经氨酸（唾液酸，NeuAc）、N-羟乙酰神经氨酸（NeuGc）6 种单糖组成[1-3]。研究表明，MOs 可作为益生元影响肠道微生物群的组成，特别是双歧杆菌和乳酸杆菌，可改善机体健康或作为抗黏附抗菌剂阻止病毒、细菌或其他病原体与肠上皮细胞结合，改变宿主上皮细胞和免疫细胞反应，发挥免疫调节作用[4-6]。与牛乳和绵羊乳相比，山羊乳寡糖（Goat milk oligosaccharides，GMOs） 组成与人乳更相似，GMOs 含量在0.25～0.3 g/L，约为牛乳寡糖含量的4 倍，绵羊乳寡糖含量的10 倍[7-8]，目前已鉴定70 多种GMOs，其种类多样性虽低于人乳但显著高于牛乳[9]。山羊乳可以作为婴幼儿寡糖的天然来源[10]，因此明确GMOs 结构组成对于GMOs 的开发与利用具有重要意义。

近年来，高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）技术被广泛应用于寡糖分析[11]。Lu 等[12]利用LCMS/MS 测定了关中和萨能奶山羊的GMOs 结构和含量，成功鉴定出64 种羊乳中寡糖，其中关中山羊奶6'-唾液酰乳糖的含量是萨能山羊奶的3.3 倍；Meyrand 等[13]利用质谱鉴定对比了人乳寡糖与GMOs 的结构差异，人乳中的复合岩藻糖基化唾液酸化寡糖在羊乳中较少存在，而GMOs 中包含人乳中不合成的N-羟乙酰神经氨酸单体。同时，为了提高质谱检测灵敏度，在质谱测定中多种化学衍生化方法被用来提高聚糖检测灵敏度，包括羟基衍生化（甲基化、乙酰化）、还原端衍生化（还原胺化反应、羟基缩合反应）等[14-15]。在糖类的质谱测定中，还原端衍生化应用广泛，还原胺化反应需除去过量试剂，而羟基缩合反应中不加入或生成盐类，可直接用质谱进行检测，减少样品损耗，羟基缩合反应中吉拉德试剂P（Girard's reagent P，GP），即1-（2-肼基-2-氧乙基）吡啶翁氯化物，以阳离子标签的形式作为MS检测增强剂，与糖链衍生后，在质谱检测中只表现出正离子峰，仅检测到[M]+离子，避免了[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+等多个离子加合物[16-17]，可简化质谱数据解释，提高检测灵敏度。此外，带正电荷的标签可以提高标记聚糖的电离效率，增强MS 分析中聚糖的检测灵敏度[18]。Lu 等[19-20]利用GP 试剂衍生化人乳及羊乳寡糖，提高人乳及羊乳寡糖的质谱检测效率，测定了不同泌乳阶段母乳及羊乳N/O-糖链变化。衍生化过程中，衍生化条件是衍生化效率的重要影响因素，影响寡糖的定量分析，然而衍生化条件对寡糖衍生化效率的影响鲜有报道。

因此，本研究以2'- FL 寡糖单体比较不同质量浓度或不同体积的GP 溶液对寡糖衍生化效率的差异，探究不同GP 衍生化条件对GMOs 衍生效率的影响，得到最优衍生化条件，为羊乳寡糖的检测提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与装置

LTQXL 高效液相色谱-质谱联用仪，美国赛默飞尔公司产品；高速离心机，安徽中科中佳公司产品；LGJ-25C 真空冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司产品；V-800 旋转蒸发仪，瑞士BUCHI 有限公司产品。

1.2 材料与试剂

2'-FL（生物试剂），上海糖门生物科技有限公司产品；水苏糖（生物试剂），上海源叶生物科技有限公司产品；Girard's Reagent P（分析纯），上海源叶生物科技有限公司产品；乙腈（色谱纯），Sigma Aldrich 公司产品；甲醇（色谱纯），Sigma Aldrich 公司产品；冰醋酸（分析纯），成都市科隆化学品有限公司产品；无水乙醇（分析纯），成都市科隆化学品有限公司产品；山羊乳，采集自西北农林科技大学克隆羊基地的萨能奶山羊。

1.3 试验方法

1.3.1 GMOs 制备

羊乳于4 ℃下13000g 离心30 min，取中间层（弃上层脂肪和下层蛋白），与两倍体积的无水乙醇混合，4 ℃过夜，4 ℃下10000g 离心15 min，收集上层清液，浓缩后冻干，得到寡糖粗品。通过石墨化碳固相萃取柱（500 mg/3 mL）纯化寡糖粗品，3 mL 乙腈、3 mL 超纯水活化和平衡石墨化碳固相萃取柱，羊乳寡糖粗品上样后，以10 mL 超纯水洗柱除盐及乳糖，最后用3 mL 25%乙腈和3 mL 含0.05%TFA 的25%乙腈洗脱，合并洗脱液后旋蒸浓缩冻干，得到GMOs。

1.3.2 GP 溶液配制

称取1.87 g Girard’s reagent P 溶于100 mL 水/甲醇/冰醋酸6∶3∶1（体积比）溶液，配置成浓度为0.1 mol/L的GP 溶液。以相同的方法分别配制浓度为0.01 mol/L和0.2 mol/L 的GP 溶液。

1.3.3 样品衍生化

称取50 mg 2'-FL，分别加入1 mL 0、0.01、0.1、0.2 mol/L GP 溶液；称取50 mg 2'-FL 或GMOs，分别加入0.2、1.0、5.0、10.0 mL 0.1 mol/L GP 溶液（以不加GP 溶液为对照），室温振荡30 min，冻干待用。称取0.30 mg 衍生后样品，将样品溶于1 mL 50%的乙腈溶液中，过0.22 μm有机滤膜注入色谱瓶中，上机检测。

1.4 试验条件

1.4.1 超高效液相色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH Amide 色谱柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）；柱温45 ℃；流速0.3 mL/min；2'-FL 进样量5 μL；GMOs 进样量15 μL。洗脱条件：流动相：A 为含0.5%氢氧化铵的50%乙腈水溶液，B 为100%乙腈，洗脱程序：0～60 min，45%A，55%B。

1.4.2 ESI-MS/MS 条件

电喷雾离子源（ESI），电喷雾电压5000 V；离子源温度（TEM）550 ℃；离子输运毛细管温度370 ℃；毛细管电压4700 V；管透镜电压250 V；鞘气体流量30.0 arb；辅助气体流量4.0 arb；离子波及气体流量0 arb。在正离子模式下200～2000 m/z 进行一级离子扫描，50～2000 m/z进行二级离子扫描。

1.5 数据处理

数据由Xcalibur 软件（Thermo Scientific）获得，通过Glycoworkbench 软件在一级质谱的质量误差小于1×10-5进行HMOs 匹配查找，并利用Glycoworkbench软件模拟HMOs 二级碎片结构进行比对，采用Origin 2019 软件绘制相关图表。

2 结果与分析

2.1 2'-FL 的GP 衍生化效率

2.1.1 GP 衍生化原理

吉拉德试剂标记糖链的原理属于腙化反应[21]，如图1 所示，利用还原性糖的还原末端与试剂的酰肼基反应，形成稳定的腙，因此反应不需要还原，可减少还原后的纯化过程中样品的损失。吉拉德试剂衍生试剂因自身带有正电荷，衍生后使被测物质也带有永久正电荷，在质谱检测时主要形成[M]+离子，避免了其它衍生试剂在质谱检测中随机出现的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+等多种金属加合离子峰并存的现象，检测灵敏度提高的同时，使质谱分析变得简单清晰，便于计算。同时样品处理方法简单，无需复杂的除盐步骤，避免了由样品损失率不同而引起定量误差的可能，提高了检测方法的准确度[22]。

图1 糖类物质与GP 衍生化反应原理[24]

2.1.2 2'-FL 与不同质量浓度GP 溶液的衍生化效率

2'-FL 与不同质量浓度GP 溶液衍生化后的提取离子流图如图2 所示，2'-FL 的保留时间在2.4 min 左右，分子量为506.17。衍生化后的2'-FL 保留时间在11.35 min左右，分子量为622.17。2'-FL 原型和衍生产物的峰面积如表1 所示，随着GP 溶液质量浓度升高，2'-FL 原型逐渐减少，越来越多的2'-FL 被GP 试剂衍生化，GP 衍生化的效率随着GP 溶液的质量浓度的增加不断升高，在浓度大于0.1 mol/L 时衍生化效率可达95%以上，说明GP 溶液对寡糖的衍生化效率受GP 溶液质量浓度的影响。2'-FL 衍生化后的峰面积明显高于未衍生化的2'-FL 寡糖单体原型，说明GP 可以提高寡糖检测的灵敏度。

表1 2'-FL 与不同质量浓度GP 溶液的衍生化效率

图2 不同衍生化条件下2'-FL 寡糖单体提取离子流图

2.1.3 2'-FL 与不同体积GP 溶液的衍生化效率

根据不同质量浓度GP 衍生化效率选择0.1 mol/L GP 溶液，进一步探究相同质量浓度下不同GP 溶液体积对GP 衍生化的影响。2'-FL 中加入不同体积0.1 mol/L GP 溶液进行衍生化，得到提取离子流图如图3 所示，2'-FL 的保留时间在2.2 min 左右，分子量为506.17，衍生化后的2'-FL 保留时间在14.6 min 左右，分子量为622.17。2'-FL 原型和衍生产物的峰面积如表2 所示，得到的衍生化效率结果与质量浓度相同，随着GP 溶液体积的增加，2'-FL 原型逐渐减少，说明越来越多的2'-FL 被GP 试剂衍生化。GP 衍生化的效率随着加入GP 溶液体积的增加不断升高，在加入1 mL GP 试剂后衍生化效率为94.1%，大于5 mL 的GP 试剂衍生化效率可达99%以上。

表2 2'-FL 与不同体积GP 衍生化效率

图3 不同衍生化条件下2'-FL 寡糖单体提取离子流图

2.2 GMOs 的GP 衍生化效率

通过比较不同浓度及不同体积的GP 溶液对2’-FL 的衍生化效率，可以发现优化衍生化试剂体积比质量浓度可得到更高的衍生化效率，因此在后续对羊乳寡糖混合物衍生化效率的探究中，固定衍生化试剂的质量浓度，得到最优衍生试剂体积，并以其中含量较高的6种羊乳寡糖的衍生化效率为例。不同体积0.1 mol/L GP 溶 液 对 6 种 羊 乳 寡 糖（H1N1F1、H2N1、H4、H1N2、H3N1、H5）的衍生化效率如表3 所示，通过峰面积可以得出与2’-FL GP 衍生化效率相同的结论，随着0.1 mol/L GP 溶液体积的增加，GMOs 原型不断减少，GMOs 衍生化产物增加。相同体积的0.1 mol/L GP 溶液下，H1N2 的衍生化效率最高，H4 的衍生化效率最低，这可能与其结构、含量有关，但在0.1 mol/L GP 溶液体积大于1 mL 时，二者的衍生化效率均可大于90 %。加入1 mL 的0.1 mol/L GP 溶液时，6 种GMOs 的衍生化效率在95%左右，加入5 mL 的0.1 mol/L GP 溶液时，6 种GMOs 的衍生化效率均在99%左右，加入10 mL 的0.1 mol/L GP 溶液时，6 种GMOs 的衍生化效率同样可达99%以上，说明随着体积的增大，GP 溶液对GMOs 的衍生化效率逐渐升高至接近100%，并保持稳定。

表3 GMOs 衍生化效率

2.3 讨论

Yu 等[20]使用10 μL 1mol/L GP 试剂优化了羊乳N-寡糖链结构判定的方法，Zhang 等[23]通过组织上GP衍生化结合MALDI-MSI，实现癌症组织样本中N-聚糖的高度敏感空间特征，不同文献中GP 衍生化条件存在差异，而其中的GP 衍生化效率未见详细讨论。通过本实验可以得到吉拉德试剂P 对人乳和羊乳具有相同的衍生化功能，衍生物均可通过HPLC-MS/MS 进行分离和分析，提高寡糖检测灵敏度，用于乳寡糖的结构和功能分析。吴智宇[24]建立了一种基于吉拉德试剂P 衍生化的d0/d5 稳定同位素标记电喷雾电离质谱相对定量分析还原性寡糖链的方法，在确定衍生化反应温度和反应时间的基础上，分别对Lac/GP摩尔比为1∶1、1∶1.5 和1∶2 条件下的衍生化产物进行了质谱检测，摩尔比为1∶1 和1∶1.5 时，反应不完全，摩尔比为1∶2 时，反应完全。此外，对吉拉德试剂对于质谱灵敏度的提高能力进行了考察，结果表明试剂可将被测物的检测灵敏度提高8 倍，与本研究结论相似，随着GP 溶液质量浓度的增加，寡糖的衍生化效率提高。摩尔质量是影响衍生化效率的重要因素，在相同摩尔质量下，溶液体积过少会导致衍生化反应不完全。在寡糖的提取过程中，同一反应温度和反应时间的基础上，利用足量的GP 试剂与寡糖完全反应是提高寡糖检测灵敏度的一种重要方式。

3 结论

本研究采用高效液相色谱-质谱联用技术分析了相同体积不同质量浓度及不同体积相同质量浓度下的GP 溶液对2’-FL 及GMOs 衍生效率的影响。结果表明，在2’-FL 衍生化过程中，GP 质量浓度和体积的增加可以提高寡糖的衍生化效率，随着GP 溶液质量浓度和体积的增加，寡糖原型显著减少，在加入0.1 mol/L的GP 溶液5 mL 时，寡糖的衍生化效率可达到99%以上。在6 种羊乳寡糖的质谱分析中可以得到相同的结果。由于GP 试剂使寡糖只显示了[M]+离子，减少了[M+Na]+和[M+K]+离子的干扰，为羊乳寡糖结构的鉴别和区分提供了便利，但在寡糖的衍生化过程中，相同的反应条件下，应考虑GP 溶液的质量浓度及体积的影响，实现寡糖完全衍生化，避免寡糖原型与衍生化产物同时大量存在，使得寡糖的定量分析更加精准。