解旋酶依赖性扩增技术研究进展

刘 迪 滕新栋（通信作者） 青岛海关（山东，青岛，266071）

闫吉辉 山东检疫处理有限公司（山东，青岛，266000）

随着全球一体化进程不断推进，人员流动与货物流通的日益频繁增加了传染病传播风险，黄热病、埃博拉、疟疾和新型冠状病毒肺炎等疾病给人类健康和社会经济发展造成了巨大的灾难，也对我国口岸卫生检疫提出了考验［1］。 传染病快速精确的检测对保障口岸正常运行、及时应对口岸突发公共卫生事件、防止境外疫情传入国内和保障国民生命安全有重要意义。

核酸扩增技术 （nucleic acid amplification testing，NAAT）在疾病辅助诊断中占有重要地位，广泛应用于国境口岸卫生检疫工作中［2］，其中等温扩增技术（isothermal amplification technology，ITA）与普通PCR 技术相比，对使用场景及仪器的精密度要求更低，灵敏度和特异性相当，在分子诊断尤其是床旁检测和现场筛查方面有较好的应用前景［3］。 等温扩增技术主要包括环介导扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、核酸序列依赖的扩增技术 （nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、 重组酶聚合酶扩增 （recombinase polymerase amplification，RPA） 和解旋酶依赖性扩增技术（helicase-dependent amplification，HDA）等。 本文着重介绍HDA 技术在病原体检测中的研究进展。

1 HDA 技术原理

HDA 技术于2004 年首次提出，与PCR 需要变温不同，HDA 在等温条件下利用解旋酶解开DNA 双链［4］。 双链DNA 首先被解旋酶分离为游离的单链形式，单链DNA 结合蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）与单链DNA 结合，稳定ssDNA 并防止互补链重新结合；两个序列特异性引物分别与稳定的单链靶DNA 杂交， 由DNA 聚合酶通过添加脱氧核苷三磷酸（dNTPs）的方式延伸与模板退火的引物产生双链DNA；最后两条新合成的双链DNA 产物作为DNA 解旋酶的底物进入下一轮扩增反应。 如此的扩增反应循环进行，从而实现产物的指数扩增。

HDA 技术最先使用大肠杆菌UvrD 解旋酶破坏双链DNA 中互补碱基之间的氢键，从3' 到5' 方向解旋双链DNA， 添加SSB 和甲基定向错配修复（MutL）蛋白，在37℃以指数方式扩增DNA，称为嗜温形式HDA（mHDA）［5-6］。 随着研究的深入，研究人员发现无需MutL 蛋白，热稳定解旋酶Tte-UvrD 与嗜热脂肪芽孢杆菌DNA 聚合酶（Bst-DNA 聚合酶）的组合可以在更高温度（60-65 ℃）下扩增，称为嗜热形式的HDA（tHDA），提高了扩增反应的效率和特异性［7］。 将Tte-UvrD 和Bst-DNA 聚合酶连接在一起构成复合酶，该酶同时具有解旋酶和聚合酶功能，进一步提高了扩增效率和扩增产物长度［8］。HDA技术优化后建立单管等温逆转录-嗜热解旋酶依赖性扩增技术（RT-tHDA），对RNA 分子、装甲RNA颗粒和RNA 病毒等RNA 靶标具有高度敏感性和特异性［9］。

2 HDA 产物检测方法

2.1 琼脂糖凝胶电泳或荧光DNA 结合剂检测

HDA 产物可通过琼脂糖凝胶电泳或荧光DNA结合剂 （如溴化乙锭或SimplySafe、GelRed、Gel-Green）等方法来检测，但难以对相似长度的非特异性扩增子定量或区分。

2.2 实时检测

实时检测包括荧光检测和电化学检测。 荧光检测利用荧光嵌入剂（EvaGreen）或荧光标记探针，进一步分析超过荧光强度阈值所需的时间获得实验结果： 荧光嵌入剂仅在与dsDNA 结合时发出荧光，从而降低背景信号； 荧光标记探针被DNA 聚合酶的5'-3' 核酸外切酶消化， 荧光基团脱离淬灭基团从而发出荧光［10］。 电化学检测用电活性嵌入剂替代荧光探针，检测时限少于1 h，可以在一次性电化学微孔板中进行高通量测量［11］。 荧光检测和电化学检测均可通过DNA 熔解曲线分析区分特异性和非特异性扩增。

2.3 扩增子捕获方法检测

扩增子捕获方法包括侧向流动装置（lateral flow devices，LFD）和基于杂交的扩增子捕获方法。 侧向流动装置包含结合生物素化扩增子的链霉亲和素包覆的金纳米粒子，对称或不对称扩增后的双标记扩增子进入LFD，检测线处固定化抗体在此处捕获荧光素标记扩增子并形成可见红色线［12］。 基于杂交的目标捕获是一种更简单且具有成本效益的方法，特定短捕获探针通常锚定在表面上，与扩增产物的生物素化链部分互补来捕获扩增产物。 目前已经研发了多种扩增子捕获方法，包括基于聚丙烯片或氮化硅晶片的DNA 芯片检测方法、 基于磁性颗粒的夹心检测法等［13-15］。

3 HDA 技术优势

3.1 使用场景要求低

HDA 技术实现了等温扩增， 反应机制简单，不需要昂贵且耗电的热循环仪，易于实现高通量自动化，适用于口岸现场检测。

3.2 检测流程简单

靶序列仅需2 个侧翼引物进行扩增。 相比之下，其它等温扩增技术往往需要复杂的实验设计和流程，例如SDA 技术需要4 个引物产生初始扩增子和修饰的脱氧核苷酸以提供链特异性切口［16］。

3.3 应用广泛

HDA 技术适用于多种类型样本， 如基因组、 质粒DNA、RNA、血液样本、细菌培养物和粪便样本等［12，17-18］。

3.4 反应迅速、灵敏度高

已在多种病原体检测中得到证明，HDA 技术的反应时间通常在30～90 min 之间， 且灵敏度和特异性高［19］。

4 HDA 技术在病原体检测中的应用

4.1 黄热病毒

通过细胞培养、基因组序列扩增或抗原免疫检测方法直接检测黄热病毒（Yellow fever virus，YFV）是确认病毒感染的首选方法，但这些方法通常不适用于一线诊断和监测。 而RT-tHDA 技术对YFV 特异性强且灵敏度高，适用于在自然感染和接种后病毒血症阶段检测血清样品中的YFV 基因组，扩增产物可用肉眼在试纸上直接读取， 简化了操作流程，适用于现场检测［20］。

4.2 埃博拉病毒

Goldmeyer 等［9］研发的等温单管一步RT-tHDA平台使用水浴或加热块等简单的仪器即可扩增特定的RNA 序列。 通过在反应中加入一种极端耐热的单链DNA 结合蛋白，可以在10 min 内将埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）的装甲RNA 扩增一百万倍，仅需30 min 即可读取结果。 该技术对EBOV 高度灵敏，扩增效率高，契合口岸检测精确高效的要求。

4.3 疟原虫

血涂片显微镜检查是诊断疟疾（Malaria）感染的金标准，但临床实验室很难正确识别患者血液中的疟原虫种类，且血清学检测对疟原虫种类特异性不足［21-22］。 目前已研发多种基于LAMP 技术的疟原虫检测技术，但LAMP 技术的复杂性增加了检测工作流程［23-24］。 基于tHDA 技术的疟疾检测仅用2 μL未处理的人类全血即可检测5 种疟原虫，且可以使用简单的手持式一次性检测设备特异性区分恶性疟原虫和间日疟原虫， 灵敏度和特异性分别为96.6%和100%，1～2 h 即可获得结果［25］。该技术简单高效、灵敏快速，适合口岸现场病原体检测。

4.4 结核分枝杆菌

结合微小等温核酸定量系统（TINY）和等温扩增装置的HDA 技术可以通过靶向结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb） 基因组中的IS6110 序列来定性检测口腔拭子中M.tb 的存在，从标本制备到结果解释仅需不到1.5 h， 且特异性强，灵敏度高［26］。 基于HDA 技术的电化学检测磁性平台可以用于检测痰、尿和胸水样本中的M.tb，对目标基因序列的检测限低至30 拷贝［27］。

4.5 生物战剂相关病原体

基于HDA 技术的等温实时TaqMan 平台（HDA-TaqMan） 结合了HDA 和TaqMan 检测的优点， 对携带炭疽芽孢杆菌DNA 纯化质粒的检测灵敏度可达至少300 fg（大约50 个基因组拷贝）；对霍乱弧菌基因组的检测灵敏度也较高，可在1 h 内检测到至少50 个拷贝［10］。

5 展望

口岸传染病监测是守卫国门安全、防止国际传染病跨境传播、保障国家生物安全的关键一环。 在当前全球传染病传播形势严峻，尤其是新冠肺炎疫情尚不能有效控制，突变毒株持续变异的情况下，口岸卫生检疫的第一要务就是对传染病及其病原体的精准识别和控制。 能匹配可移动、便携式设备，且检测结果快速精准、稳定可靠的病原体检测方法对于口岸传染病监测意义重大。HDA 检测技术作为一种特异性强、灵敏度高、检测流程简单、用途广泛的检测方法，高度契合口岸对于传染病监测精准高效的需求，进而为口岸传染病监控及重大新发突发传染病疫情处置提供更广阔的发展平台。 尽管有以上诸多优点，HDA 技术仍有一些局限需要克服：例如更容易受到引物二聚体产物的扩增子污染，不同样本中潜在抑制剂导致的假阴性以及低温扩增过程中因错误配对产生的非特异性扩增产物导致的假阳性等，因此仍需进一步改进优化［19］。

HDA 技术自研发至今已经有了较大发展，目前也已有成熟的市售试剂盒：BioHelix（美国马萨诸塞州贝弗利）公司生产的IsoAmp®II 通用tHDA 试剂盒和IsoAmpIII 通用tHDA 试剂盒。 此外，通过与其它技术的结合，HDA 技术检测水平更高效、高通量：与微流控技术结合的HDA-高通量微芯片装置［28］，HDA-ELISA 技术［29］，HDA/薄膜生物传感器等［30］。Ramalingam 等［28］设计的基于HDA 技术的微流体装置，可在30 min 内完成对SARS 冠状病毒的实时检测， 而利用HDA 技术对SARS-CoV-2 病毒进行实时检测有待进一步研究。