二氢杨梅素对Bloom解旋酶结构和生物学活性的影响

2019-09-24刘金河张望明晏文涛许键炜葛章文

中国药理学通报 2019年10期

刘金河，张望明，晏文涛, 许键炜，葛章文

(1. 贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室，组织工程与干细胞实验中心，贵州省再生医学重点实验室，贵州贵阳 550004; 2. 中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室;3. 贵州省人民医院检验科，贵州贵阳 550002；4. 贵州中医药大学第一附属医院检验科，贵州贵阳 550001)

Bloom综合征(Bloom syndrome，BS)是一种隐性的常染色体遗传病，临床主要特征是生长发育迟缓、面部有对光敏感的斑、免疫缺陷、易患多种癌症及不孕不育[1]。BS主要是由细胞内的Bloom解旋酶(Bloom helicase，BLM)突变导致基因组的不稳定，进而导致各种基因突变发生并诱发癌症。BLM解旋酶能够结合双链DNA，利用ATP提供能量，由3′-5′解开双链DNA[2]。因此，研究小分子药物对BLM解旋酶功能的影响，寻找靶向特效抑制药物，对治疗此类癌症具有重要意义。本研究中使用的BLM解旋酶为该酶的核心区域，氨基酸残基序列区间为642-1290，简称BLM642-1290。

二氢杨梅素(dihydromyricetin，DMY)是一种黄酮类化合物(结构见Fig 1)，主要存在于杨梅科、柳科、葡萄科、藤黄科等植物中，在藤茶属植物中含量最高[3-4]。最近的研究表明，DMY具有广泛的药理活性，能够通过促进细胞凋亡，多环节阻滞或延缓肿瘤的发生发展[5-6]。在急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)的损伤修复中，通过抑制TRAF3-p38信号通路来抑制AP的应答[7]。在对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)诱导的小鼠急性肝损伤中，具有良好的修复作用[8]。在抑制肝脏的脂肪堆积，防止动脉粥样硬化方面，也具有明显的疗效[9]。在临床上，能缓解地塞米松造成的肌肉萎缩[10], 能通过抑制semaphorin 4D来抑制结直肠癌的发展[11]。另外，DMY的抗氧化作用也比较强，在抗炎、抗病原微生物、解酒护肝、调血脂等方面也有广泛的应用，具有较大的临床应用潜力[12]。

Fig 1 Chemical structure of DMY

目前对DMY的研究有很多，主要关注DMY的各种药理作用，其中抗肿瘤方面着重在肝癌、乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤方面，而DMY对这些癌细胞及活体影响的分子机制的研究却鲜见报道。本文采用圆二色谱(circular dichroism，CD)、自由磷检测、紫外光谱、荧光偏振等技术和方法，研究DMY对BLM642-1290解旋酶的二级结构、生化活性、构象的影响，探讨DMY与BLM解旋酶相互作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂DMY(CAS27200-12-0,20 mg，上海源叶生物公司)；ATP酶活性检测试剂盒(英国Innova Biosciences公司)；DNA底物杂交缓冲液(20 mmol·L-1Tris-HCl，100 mmol·L-1NaCl，pH 7.9)；荧光偏振实验反应缓冲液(20 mmol·L-1Tris-HCl，25 mmol·L-1NaCl，3 mmol·L-1MgCl2和0.1 mmol·L-1DTT，pH 7.9)；ATP酶活性检测缓冲液(0.1 mol·L-1Tris-HCl，5 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1ATP和4 nmol·L-1ssDNA，pH 7.9)；紫外光谱实验缓冲液C(20 mmol·L-1Tris，500 mmol·L-1NaCl，500 mmol·L-1咪唑，10%甘油，pH 7.9)；圆二色谱实验缓冲液为1×PBS。其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器Ultrospec2100 Pro紫外分光光度计(美国GE公司)；NGCTM蛋白质纯化系统(美国Bio-Rad公司)；Beacon 2000荧光偏振仪(美国Panvera公司)；Milli-Q 超纯水系统(美国Millipore Corp)；Bio-Logic电化学工作站(法国，Bio-Logic)。

1.3 DNA底物实验中的DNA底物由北京鼎国工程技术有限公司合成，其长度和序列见Tab 1。在40 μL DNA杂交缓冲液中，分别加入5 μL 100 μmol·L-1A1和A2单链DNA(ssDNA, A2)，90 ℃水浴3 min，室温下自然冷却复性，获得双链DNA(dsDNA，A1A2)，其作为荧光偏振实验中检测所需的双链DNA底物。ATP酶活性测定中使用A1作为DNA底物。

1.4 BLM642-1290解旋酶的制备BLM解旋酶的重组大肠杆菌由西北农林科技大学奚绪光教授馈赠。首先，将BLM642-1290解旋酶大肠杆菌的菌种在37 ℃复苏，然后接种到5 L培养基中进行扩大培养；在18 ℃条件下，扩大培养后的菌种中加入终浓度0.4 mmol·L-1IPTG诱导表达20 h; 4 ℃条件下，4 000 r·min-1离心15 min，收集管底部菌体，加入适量buffer A(20 mmol·L-1Tris，500 mmol·L-1NaCl,0.5 mmol·L-1咪唑, 10%甘油，pH 7.9)，高压细胞破碎仪(英国Constant Systems公司)进行细胞破碎(压力为21 KPSI)，破碎1次，离心收集上清液; 在蛋白纯化仪上，用镍亲合层析柱和Superdex-200(美国GE Healthcare公司)进行分离和纯化，获得可用于开展生物学活性研究的BLM642-1290解旋酶(Fig 2)，考马斯亮蓝染色检测BLM642-1290蛋白纯度(Fig 3)。本实验所需蛋白为Fig 3中1号泳道BLM，BCA法测定BLM642-1290解旋酶蛋白浓度为0.383 g·L-1。

Tab 1 Oligonucleotide sequences used in this study

Fig 2 Purification of BLM642-1290 by Ni affinity chromatography and molecular sieve chromatography

Fig 3 Determination of BLM helicase purity after molecular sieve chromatography

1.5 DMY对BLM642-1290解旋酶构象的影响缓冲液C中，终浓度为0.8 μmol·L-1BLM642-1290解旋酶与不同浓度梯度的DMY混合，25 ℃放置2 h后，于紫外分光光度计中扫描图谱，速度为每次3 min，该反应总体系为200 μL。另外，单独扫描不同浓度梯度的DMY在缓冲液C中的紫外吸收光谱。反应在室温下进行，扫描速度750 nm·min-1，扫描精度1 nm，扫描范围200～400 nm。每个图谱均为10～15个稳定数据的平均值。

1.6 DMY对BLM642-1290解旋酶二级结构的影响在1×PBS缓冲液中，终浓度为0.8 μmol·L-1BLM642-1290解旋酶与不同浓度的DMY混合，总反应体系为400 μL(1 mm光程比色皿)，先室温下反应30 min后，再利用stop-flow电化学工作站(法国BioLogic Science Instruments公司)进行CD的检测，扫描速度每次5 min，直到CD图谱达到稳定，连续测定20次稳定后的CD图谱数据，拟合获得的20次实验数据，实验重复3次。色谱扫描区间为190～260 nm，扫描精度为1 nm，狭缝宽度为5 nm。

1.7 DMY对BLM642-1290解旋酶DNA结合活性的影响在此实验中，采用2种方式来研究DMY对BLM642-1290解旋酶DNA结合活性的影响[13]。第1种，BLM解旋酶与2 nmol·L-1的DNA(A2或A1A2)相互结合形成复合物，然后用不同浓度的DMY进行滴定；第2种，在室温下，不同浓度的DMY首先与BLM642-1290解旋酶反应5 min，然后再加入到2 nmol·L-1DNA(ssDNA或dsDNA)的反应缓冲液C中，荧光偏振仪检测。实验重复3次，数据为10～15个稳定偏振值平均之后的结果。

1.8 DMY对BLM642-1290解旋酶DNA解链活性的影响此方法借鉴刘金河等[13]的实验方法，25 ℃条件下，DMY与BLM642-1290解旋酶混合5 min后，加入到含2 nmol·L-1A1A2反应buffer中检测偏振值的变化，当偏振值达到稳定后，再加入终浓度为0.2 mmol·L-1ATP，10 s检测1次数据直到数据稳定，取数据稳定后的10～15个荧光偏振值数据求平均值，并进行3次实验重复。DNA解链的速率常数可根据方程(1)获得：

At=A1exp(-kobst)

(1)

式中At是解链时间为t时的荧光偏振值，A1是解旋酶与dsDNA完全结合时的荧光偏振值。

1.9 DMY对BLM642-1290解旋酶ATP酶活性的影响不同浓度DMY分别与终浓度10 nmol·L-1的BLM642-1290解旋酶混合5 min后，将该混合液与ATPase活性检测液按照1∶1(V/V)的比例混合，并开始计时，在2.5、5、7.5、10、15、20、25、30 min时间点，分别取出反应混合液200 μL，迅速加入到含50 μL Goldmix的EP管中，以终止ATP的水解反应，2 min后，加入稳定剂20 μL，平衡30 min，在650 nm波长下检测其吸光度值[13]。如果酶活力定义为每分钟催化1 mol底物水解所需的酶量(U·mL-1·min-1)，BLM642-1290解旋酶的酶活力可由方程式(2)计算得出。

(2)

式中，A是根据标准曲线测出的Pi浓度(μmol·L-1)；B是反应时间min；C是解旋酶的稀释倍数。

2 结果

2.1 DMY能够改变BLM642-1290解旋酶的空间结构DMY对BLM642-1290解旋酶的紫外吸收的影响如Fig 4所示，DMY在237 nm和330 nm处具有两个紫外吸收峰(Fig 4A),而BLM642-1290解旋酶在237 nm和276 nm处具有两个紫外吸收峰(Fig 4C)。当DMY与BLM642-1290解旋酶相互作用后，紫外吸收峰位发生了偏移，从237 nm处的红移到239 nm，峰型基本保持不变(Fig 4B)。进一步分析可知，在237 nm处，BLM642-1290解旋酶与DMY相互作用后的紫外吸收值大于BLM642-1290解旋酶与DMY的紫外吸收值之和(1.25>0.49+0.25)(Fig 4C)，表明DMY与BLM642-1290解旋酶之间发生了相互作用，BLM642-1290解旋酶的构象发生了变化。将[DMY]/[BLM642-1290]的比值与紫外吸收值进行线性拟合，得一条直线(斜率k=0.0235)，可知BLM642-1290解旋酶与DMY有且仅有1个结合位点(Fig 4D)。

2.2 DMY能部分解开BLM642-1290解旋酶二级结构由Fig 5A可知，BLM642-1290解旋酶的α-螺旋结构在不同浓度的DMY的作用下都有一定的结构变化，208 nm和222 nm处的负峰也清晰可见，表明BLM642-1290解旋酶的结构遭到一定程度的破坏，但是不能完全破坏其α-螺旋结构，而是存在一个最适DMY浓度。由Fig 5B可知，在DMY浓度为0～25 μmol·L-1时，随着DMY浓度的增加，α-螺旋在一定程度上逐渐解旋；当DMY浓度大于25 μmol·L-1时，随着DMY浓度的增加，α-螺旋又逐渐从松散状态基本回到最初的状态。

Fig 4 Ultraviolet(UV) absorption spectra of DMY interacted with BLM642-1290 helicase

Fig 5 Circular dichroism(CD) spectra of DMY interacted with BLM642-1290 helicase

2.3 DMY能够抑制BLM642-1290解旋酶DNA结合活性DMY对BLM642-1290解旋酶的DNA结合活性的影响见Fig 6。由图可知，无论dsDNA(Fig 6A)还是ssDNA(Fig 6B)作为BLM642-1290解旋酶结合活性的底物，BLM642-1290与DNA相互结合而产生的荧光偏振值的增加量，都随DMY浓度的增加而明显减小(P<0.01)；另外，DMY单独滴定dsDNA或者ssDNA的荧光偏振值无明显变化，说明DMY与DNA并无相互作用(Fig 6C)。由此可以推断，DMY与BLM642-1290解旋酶仅有的1个结合位点是在BLM642-1290解旋酶的DNA结合位点上，并且其与BLM642-1290解旋酶DNA结合位点的亲和力大于DNA。

2.4 DMY能抑制BLM642-1290解旋酶DNA解链活性DMY对BLM642-1290解旋酶的解链活性的影响见Fig 7。由Fig 7A可见，随着反应体系中DMY终浓度的逐渐增加(0～25.33 μmol·L-1)，因解链而降低的荧光偏振值(A1-A2)逐渐减小，表明BLM642-1290解旋酶的解链活性逐渐降低。由此可知，BLM642-1290解旋酶的解链活性被DMY抑制，但不能完全抑制其解链。根据公式(1)进一步分析了DMY存在下BLM642-1290解旋酶的Kobs值的变化(Fig 7B)，随着DMY浓度的增加，BLM642-1290解旋酶的Kobs值逐渐减小，表明DMY能够抑制BLM642-1290解旋酶的解链活性。

2.5 DMY能明显抑制BLM642-1290解旋酶的ATPase活性DMY对BLM642-1290解旋酶的ATPase活性的影响见Fig 8。由Fig 8A可知，DMY能明显抑制BLM642-1290解旋酶的ATPase活性(P<0.05)，且酶活力的高低与DMY的浓度呈负相关,但不能完全抑制ATPase活性。由Fig 8B可知，在相同的酶浓度条件下，随着时间的延长，BLM642-1290解旋酶的酶活力逐渐下降，表明BLM642-1290解旋酶的酶活力与时间呈负相关。通过米氏方程双倒数作图法进一步分析实验数据，计算出酶反应的Vmax、Km等常数，结果见Tab 2。随着DMY浓度的增加，Vmax逐渐减小，而Km保持稳定，且Kcat减小，证明DMY竞争性抑制BLM解旋酶的ATPase活性。

3 讨论

BLM解旋酶是SF2超家族当中的一员，由解旋酶结构域(helicase)、RecQ保守的C末端结构域(RecQ-Ct)和解螺旋酶RNA酶D碳末端(HRDC)结构域组成[14]。Helicase结构域具有该家族特有的保守基序(Ⅰ、Ⅱa、Ⅲ-Ⅵ)，结构和功能研究显示，motif Ⅰ和motif Ⅱ与NTP的结合有关。Motif Ⅳ和motif Ⅵ与ATP水解和核酸的结合有关，motif Q是SF2特有的保守序列，位于motif Ⅰ N末端前，其作用与ATP结合和水解有关。RecQ-Ct结构域具有DNA结合活性及ATPase活性，但不能结合ATP。HRDC结构域位于BLM解旋酶的C末端，能够辅助性结合DNA，进而调节其解链功能，也可增强和稳定BLM解旋酶与DNA的结合，但不具有催化活性[13]。

Fig 6 Effects of DMY on DNA-binding activity of BLM642-1290 helicase

Tab 2 Effects of DMY on ATPase activity constants of BLM642-1290 helicase

Fig 7 Effects of DMY on DNA unwinding activity of BLM642-1290 helicase

Fig 8 Effects of DMY on ATPase activity of BLM642-1290 helicase

从CD实验结果可知，DMY对BLM解旋酶的二级结构具有一定影响，使得BLM解旋酶的结构逐渐发生一定程度的松散，因α-螺旋结构的微变化，使得Helicase结构域内负责与DNA相互结合的活性基团的位置和距离发生微小变化，从而使得BLM与DNA的结合能力下降，而结合活性实验中进一步看到BLM解旋酶与DMY的结合力大于与DNA的结合能力，因此，DMY抢夺BLM解旋酶的DNA结合位点。从紫外光谱实验和解链活性实验可以看出，DMY与BLM解旋酶的结合仅有1个结合位点，而在结果“2.3”的DMY对BLM642-1290解旋酶DNA结合活性的影响当中可以看到，随着DMY的浓度逐渐增加，BLM-dsDNA或BLM-ssDNA的偏振值增加量(A1-A0)逐渐降低，甚至为零，也就是说DMY能将DNA从BLM642-1290置换下来，并占据DNA的结合位点，另外，因ATPase活性的实现区域在BLM642-1290解旋酶的helicase结构域中，为此我们大胆推断，这个结合位点很可能是在解旋酶结构域上，且阻止了motif Ⅳ和motif Ⅵ与DNA的结合，这种结合与DNA形成了可逆的竞争性机制。BLM解旋酶是人体细胞内普遍存在的一类具有解开双链DNA能力的活性蛋白质，它参与细胞内DNA的复制、重组、修复、转录等代谢过程，在维持染色体的稳定性方面具有重要的作用。BLM解旋酶在多种肿瘤细胞体内表达升高，比如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、恶性淋巴瘤等[2,15]，抑制BLM解旋酶的活性或表达量，能明显抑制肿瘤细胞的生长。例如，甘草次酸下调BLM解旋酶的表达，并抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖[15]，敲减BLM基因后的PC3细胞增殖能力、侵袭能力和迁移能力明显被丝裂霉素C抑制[16]。因此，寻找副作用小、价格便宜的小分子药物也就显得非常重要，这也为抗肿瘤药物的研发提供了新的思路。而提取DMY的植物在国内分布广泛、取材容易、成本低廉，成药后价格不高，值得进一步的研究。本实验的基础研究验证了DMY确实可以抑制癌症相关蛋白Bloom解旋酶的活性，也就在一定程度上说明DMY存在成为癌症治疗药物的可能性，后续的动物实验、临床实验的结果如何，有待进一步的研究。