基于气相色谱检测法研究椪柑酒中甲醇、杂醇油的生成规律

湛佳佳，张香，胡亚平，2，张志旭，周柄屹，周泉，秦丹，2*，曾璐*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省发酵食品工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；3.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；4.湖南农业大学国家中医药管理局亚健康干预技术实验室，湖南 长沙 410128；5.天下果业开发有限公司，湖南 吉首 416000）

椪柑（Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan）又名芦柑，属于芸香科柑橘属植物果实,富含氨基酸、维生素C、矿物质等营养元素，以及酚类、类黄酮、胡萝卜素等生物活性物质，是一种营养价值较高的水果[1]。椪柑酒是以椪柑为原料，取汁后，经发酵、陈酿、澄清后得到的低酒精度果酒[2]，保留了原料中的多种活性成分，适量饮用有益于身体健康[3-5]。但在主发酵过程中，椪柑原料的果胶物质极易被转化生成甲醇、杂醇油等副产物[6-7]。其中，甲醇对人体可产生麻醉作用，超过5 g会出现严重中毒，超过12.5 g就可能导致死亡[8-9]。杂醇油的种类较多，主要有正丙醇、异丁醇、异戊醇，在酒体中的含量分别是甲醇的3.5、8、19倍[10-12]，含量过高会使酒体产生异杂味[13]，且毒性较大，易使人产生头部神经疼痛、面红耳赤、头晕心跳、恶心呕吐等现象，危害人体健康[14]。然而，目前除了在GB 15037—2006《葡萄酒》中对白、桃红葡萄酒的甲醇含量有<250 mg/L的规定外，其他果酒尚缺失相关标准，对其甲醇、杂醇油的含量未有统一规定。所以在酿造过程中对果酒中甲醇和杂醇油进行调控和测定显得十分重要。现阶段常用的测定方法主要是比色法[15-16]，但操作繁琐、耗时较长，难以快速及时地了解甲醇和杂醇油的含量变化情况。也有研究采用气相色谱法对果酒中甲醇和杂醇油进行测定，具有操作简单、灵敏度高、检测限高等优点，物质完全分离需要24 min左右[17-19]。本文采用气相色谱法对主发酵期间椪柑酒中甲醇和杂醇油含量进行检测，以期为椪柑酒的品质调控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

吉品椪柑：市售，产自湖南湘西自治州；葡萄酒果酒酵母SY：安琪酵母股份有限公司；蔗糖：柳州市古丽冰糖有限公司；甲醇（色谱纯）、正丙醇（色谱纯）、异丁醇（色谱纯）、异戊醇（色谱纯）、乙醇（色谱纯）、4-甲基-2-戊醇（色谱纯）：南京化学试剂股份有限公司。

1.2 仪器与设备

厨房机械原汁机（JYZ-E8）：九阳股份有限公司；型生化培养箱（MJ-250B5-Ⅱ）：上海新苗医疗器械制造有限公司；气相色谱仪（GC-2010plus）：日本岛津公司。

1.3 椪柑酒的生产工艺

1.4 色谱条件

色谱柱：DB-WAX石英毛细管柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）；进样口温度250℃；检测器温度250℃；H2流量47 mL/min，空气流量400 mL/min；尾吹速率30 mL/min；载气 N2，流量 2.8 mL/min，分流比 50∶1。

升温程序：初温45℃，恒温3 min；以5℃/min升至70℃，恒温2 min；以15℃/min升至130℃，恒温2 min；以40℃/min升至200℃，恒温2 min。

1.5 椪柑酒中甲醇、杂醇油含量的测定

1.5.1 溶液配制

单一标准品溶液：准确吸取甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇2.00 mL分别于100 mL容量瓶，用40%乙醇水溶液定容。

内标溶液：准确吸取2mL4-甲基-2-戊醇于100mL的容量瓶，用40%乙醇水溶液定容。

甲醇及杂醇油混合标准母液：准确吸取甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇2.00 mL于100 mL容量瓶，用40%乙醇水溶液定容。

甲醇及杂醇油混合标准溶液：准确吸取上述混合标准母液2 mL和内标溶液2 mL于100 mL容量瓶，用40%乙醇水溶液定容。

1.5.2 标准曲线的绘制

分别向5个10 mL容量瓶中加入0.2 mL 20 g/L的4-甲基-2-戊醇（内标物）溶液，再分别加入0.1、0.5、1.0、3.0、5.0 mL混合标准母液，均用40%乙醇水溶液定容。以醇和内标物的质量浓度之比为横坐标，醇和内标物的峰面积之比为纵坐标，绘制甲醇和杂醇油的标准曲线图。定量限为信噪比的10倍。

1.5.3 甲醇、杂醇油的定性

分别吸取单一标准品溶液各进样1 μL，得到甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇的保留时间，再吸取混合标准溶液进样1 μL，以单一标准品溶液和混合标准溶液的出峰时间为对照进行定性，得到甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇、4-甲基-2-戊醇的色谱图。

1.5.4 气相色谱检测样品准备

参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行试样制备。吸取100 mL试样于500 mL蒸馏瓶中，加入100 mL水和几颗玻璃珠，缓慢加热蒸馏，收集馏出液，吸取10 mL馏出液于试管中，加入0.10 mL 4-甲基-2-戊醇标准溶液，混匀，备用。

1.5.5 精密度与重复性分析试验

取同一标准溶液连续进样5次，计算峰面积的相对标准偏差（relative standard deviatio，RSD），以考察仪器的精密度；取同一酒样，平行测定5次，计算甲醇和杂醇油含量的RSD值，以考察重复性。

1.5.6 稳定性分析试验

取同一椪柑酒样品，分别于0、4、8、12 h进样测定，记录色谱图峰面积，计算RSD。

1.5.7 加标回收率分析试验

取2 mL内标溶液于100 mL容量瓶，用椪柑酒定容，测定甲醇、杂醇油含量。分别取2 mL内标溶液和混合标准溶液，用同一酒样定容至100 mL，记录色谱图峰面积，计算甲醇、杂醇油回收率。

1.6 数据统计与分析

应用Excel和SPSS软件进行统计和方差分析，使用Origin 2019软件进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 椪柑酒中甲醇和杂醇油同步检测法的建立

椪柑酒样品及标准品甲醇、杂醇油的气相色谱见图1。

图1 标准溶液及椪柑酒样品溶液中甲醇、杂醇油的气相色谱图Fig.1 Gas chromatograms of methanol and fusel oil in standard solution and citrus wine sample solution

由图1可知，该方法可使甲醇、杂醇油在13 min内完全分离。

2.2 单一醇的线性考察及定量限

甲醇、杂醇油的回归方程和定量限见表1。

表1 甲醇、杂醇油的回归方程和定量限Table 1 Regression equation and quantification limit of methanol and fusel oil

由表1可知，在20mg/L～1000mg/L质量浓度范围内，甲醇及杂醇油的峰面积之比和浓度之比均具有较好的线性关系，且相关系数均大于0.9990。因此，该方法能够精确地测定甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇的含量。

2.3 精密度和重复性试验

精密度和重复性试验结果见表2和表3。

表2 精密度试验结果Table 2 Precision test results

表3 重复性试验结果Table 3 Repeatability test results

由表2可知，同一标准溶液连续进样5次，甲醇、杂醇油标准溶液的相对标准偏差（RSD）分别为2.24%、1.64%、1.78%、0.91%，表明仪器精密度良好。如表3所示，对同一椪柑酒平行测定5次，样品中甲醇、杂醇油的RSD分别为2.40%、3.55%、3.64%、2.86%，表明该方法的测定值重复性良好。

2.4 稳定性试验

稳定性试验结果见表4。

表4 稳定性试验结果Table 4 Stability test results

由表4可知，分别在4个时间点测定椪柑酒中甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇。其峰面积RSD为1.93%～2.60%，表明该方法在12 h内的测定值稳定性良好。

2.5 加标回收率试验。

加标回收率结果见表5。

表5 加标回收率试验结果Table 5 Results of spike and recovery test

由表5可知，在已知浓度的溶液中加入甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇标准溶液进行测定，根据色谱图峰面积计算回收率。椪柑酒中甲醇和杂醇油正丙醇、异丁醇、异戊醇的加标回收率在96.29%～103.36%之间，RSD分别为0.18%、0.16%、0.12%、0.06%，回收率较高且稳定，说明该方法准确可靠，可用于椪柑酒中甲醇和杂醇油的测定。

2.6 椪柑酒主发酵过程中酒精度和残糖变化规律

椪柑酒主发酵期间酒精度和残糖含量的变化结果见图2。

图2 主发酵期间酒精度和残糖含量的变化Fig.2 Changes in the content of alcohol and residual sugar during main fermentation

由图2可知，主发酵过程中随着发酵时间的延长，总糖逐渐被酵母菌分解消耗，第2天总糖的消耗速率最快，酒精度迅速升高。说明这期间酵母菌的代谢活动最旺盛，6 d后酒精度逐渐趋于平缓，9 d后残糖含量和酒精度基本不变，表明发酵过程已基本完成。

2.7 椪柑酒主发酵过程中甲醇和杂醇油生成规律

甲醇和杂醇油的生成规律见图3、图4。

图3 主发酵期间甲醇含量变化Fig.3 Changes in the content of methanol during main fermentation

由图3可知，主发酵期间椪柑酒甲醇含量随着发酵时间的延长逐渐升高，前5天甲醇含量增长速度较快，第6～9天增长速度缓慢，在第8天甲醇含量达到峰值[（261.14±5.58）mg/L]后趋于稳定。主要是因为果胶在果胶酶作用下水解生成甲醇，由于前期果胶酶活力旺盛，随着主发酵的进行，可迅速分解发酵体系中的果胶物质，导致主发酵后期果胶含量减少，使得甲醇的生成量也逐渐降低[20]。

由图4可知，主发酵期间前4 d正丙醇、异戊醇、异丁醇含量增长速度较快，分别在第9、11、8天达到峰值[（171.40±3.69）、（390.29±11.80）、（44.07±0.97）mg/L]。主发酵期间椪柑酒中的主要杂醇油的含量由高到低依次为异戊醇、正丙醇、异丁醇，其中异戊醇是椪柑酒中主要杂醇，占杂醇油总质量的70.99%。

3 结论

本试验所采用的气相色谱检测方法能使甲醇、杂醇油在13min内完全分离，可在短时间内同步测定甲醇、杂醇油的含量。测定结果表明：主发酵期间椪柑酒中甲醇、正丙醇、异戊醇、异丁醇的含量均呈先升高后趋于稳定的规律，分别在第8、9、11、8天达到峰值[（261.14±5.58）、（171.40±3.69）、（390.29±11.80）、（44.07±0.97）mg/L]，其中甲醇含量超出国家标准规定的250 mg/L限定值，表明该酒样还需进行发酵优化或陈酿处理。本试验结果可为椪柑酒中甲醇、杂醇油含量检测提供有效方法，同时为后续果酒品质优化提供研究方向。