不同红曲菌株对多糖饮料品质的影响

况嘉铀，李莹莹，郑平，吴紫婷，刘枣*，王伟平

（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

多糖是一类由多个相同或不同类型单糖以糖苷键方式结合而成的高分子碳水化合物，广泛分布于高等植物、地衣、海藻、动物和微生物中，具有可以激活人体免疫细胞[1]、诱导癌细胞凋亡[2]、清除自由基[3]和降低血糖、血脂[4]等生物活性[5]。且多糖可以影响风味物质的释放，风味物质相对浓度增加，从而使多糖产品具有更好的感官品质[6]，因此多糖越来越多地被应用于饮料的研制。目前，市场上大部分的多糖饮料是通过添加植物提取得到的多糖制备而成，而发酵多糖饮料产品较少。

红薯是一种营养丰富的天然滋补食品，富含蛋白质、多糖、多种维生素等，对促进人体肠道消化，增强人体免疫力起着重要作用[7]。我国红薯种植面积为7500万亩～8 000万亩，资源丰富。红曲菌是一种具有较高食用和药用价值的丝状真菌，可以产生红曲色素、红曲多糖、monacolin K、γ-氨基丁酸等多种功能活性物质，还能产生天然色素和酸、醇、酯等丰富的风味物质[8]，其中红曲色素是一种天然可食用色素，广泛地应用于食品领域[9]。红曲多糖是一种真菌多糖，主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖通过β-1，3糖苷键组成，具有抗肿瘤、提高免疫力等生物功能。红曲菌产生的其他代谢物质还具有降血压、降血脂等作用，在抗癌、抗疲劳、防治骨质疏松等方面也有一定功效[10]。红曲菌还可产生苯乙醇、辛醇、2-壬酮、亚油酸乙酯等风味物质，这些风味物质能够赋予红曲产品丰富的香味[8]。红曲菌不仅可以产生多种活性物质还能产生多种风味物质，可用作发酵饮料的菌种。

不同红曲菌代谢能力及产代谢产物的能力存在明显差异[11-14]。本文以实验室3株红曲菌Monascus GN、H4000和Z505为研究对象，以新鲜红薯为原料，研究不同菌株液态发酵新鲜红薯产红曲色素、红曲多糖等代谢产物能力，对发酵液进行感官评分，筛选得到优良菌株，为以后制备红薯红曲多糖饮料的研究提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

红曲菌（Monascus）GN、Z505、H4000：湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室保藏。

新鲜红薯：市售；葡萄糖、可溶性淀粉、酵母粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨（分析纯）：北京双旋微生物培养基制品厂；琼脂（分析纯）：武汉市华顺生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

pH计（PHS-3C）：上海仪电科学仪器股份有限公司；立式自动压力蒸汽灭菌器（GI65DWS）：致微（厦门）仪器有限公司；垂直流超净工作台（ZGJH-1214）、双层特大容量全温度恒温培养振荡器（ZHWY-2112B）：上海智城分析仪器制造有限公司；电热恒温培养箱（DNP-9052）：上海精宏试验设备有限公司；高速冷冻离心机（Fresco 17）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；可见光分光光度计（722S）：上海精密科学仪器有限公司。

1.3 培养基

斜面培养基：葡萄糖6%、蛋白胨2%、可溶性淀粉3%、琼脂3%，115℃灭菌30 min。

种子培养基：新鲜红薯洗净去皮，切成1 cm3的方块。新鲜红薯块10%、葡萄糖2%、蛋白胨0.6%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.2%，摇瓶培养，装液量为200 mL/500 mL，121℃灭菌20 min。

发酵培养基：新鲜红薯洗净去皮，切成1cm3的方块。新鲜红薯块20%、葡萄糖2%、酵母粉0.14%、蛋白胨0.8%、KH2PO40.1% 、MgSO4·7H2O 0.05% 、ZnSO40.1% 、CaCO30.1%，装液量为100 mL/250 mL，121℃灭菌20 min。

1.4 方法

1.4.1 红薯红曲多糖饮料工艺流程

红曲菌→菌种活化→液体二级种子→接种发酵培养基→发酵→过滤除菌→后熟→调配→巴氏灭菌→灌装→检验→成品。

1）菌种活化：将3种红曲菌株分别接种到配制好的斜面培养基上，于30℃下恒温培养1周左右。

2）液态种子培养：用接种环在长好的斜面培养基中刮取两环接种到种子培养基中，30℃、200 r/min培养2 d。

3）接种：将冷却后的发酵培养基接入体积分数为10%的二级种子液。

4）发酵：将接种后的培养基置于30℃、200 r/min的摇床中发酵培养6 d。

5）过滤除菌：将发酵后的红曲菌发酵液经过滤得到过滤液，再将过滤液4 000 r/min离心10 min得到上清液。

6）低温后熟：将过滤离心得到的上清液转移到干净的玻璃瓶中，封口，置于4℃冰箱进行低温后熟。

7）调配：对低温后熟后的产品进行产品调配，使产品符合国家标准GB/T 10789—2015《饮料通则》（含第1号修改单）。

8）巴氏灭菌、灌装：将低温后熟经调配的红曲菌发酵饮料进行巴氏灭菌，并进行灌装。

9）成品、检验：对发酵饮料进行感官评分、理化及微生物指标的检测。

1.4.2 pH值的测定

发酵液pH值采用pH计测定。

1.4.3 红曲色价的测定

移取1 mL发酵液加入9 mL 70%的乙醇溶液，置于60℃恒温摇床中，180 r/min萃取1 h，4 000 r/min离心15 min，取上清液稀释至适宜倍数，在410、470、505 nm处分别测定红曲黄色素、红曲橙色素、红曲红色素3种色素的吸光值。计算公式如下[15]。

红曲色素的色价/（U/mL）=吸光值×稀释倍数

1.4.4 红曲多糖的测定

取过滤后的滤液5 mL，加入3倍体积的无水乙醇，在4℃醇沉48 h，取出后4 000 r/min离心15 min，弃去上清液，在50℃烘箱烘干至恒重，加入蒸馏水溶解并定容至50 mL，取0.5 mL上述溶液加入1.5 mL蒸馏水，加入1 mL 5%苯酚溶液，摇匀，再加入5 mL浓H2SO4，振荡摇匀，在沸水浴中反应15 min，迅速冷却，测定490 nm处吸光值[16]。

1.4.5 桔霉素的测定

桔霉素测定采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法，取上清液 5 mL，加入10 mL的无水乙醇，在60℃恒温摇床中200 r/min萃取1 h，在8 000 r/min的条件下离心10 min，吸取上清液，经0.45 μm有机滤膜过滤，即得待测液。

HPLC条件：流动相为超纯水（用磷酸调pH值至2.5）∶乙腈=50∶50（体积比）；荧光发射波长为 331 nm，激发波长为500 nm；色谱柱为EclipseXDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；体积流量为 1 mL/min；柱温 28 ℃；上样量（标准品及样品）均为20 μL。

1.4.6 感官评分方法

参考刘琨毅等[17]的方法并稍作修改，选择10名评分员组成感官评分小组，对红曲菌发酵液的色泽、组织状态、香气等方面进行评分。产品评分在常温下进行，并采取随机编码形式。评分时需给予评分员充足的时间，并在评分的过程中不断呼吸新鲜空气以保证评分结果不被外来混杂气味所干扰。感官评分内容和标准见表1，由10人评分后取平均值。总分=色泽外观×40%+香气×60%。

表1 感官评分Table 1 Sensory evaluation

1.5 数据分析与处理

试验设置3个重复，每个单因素试验进行3次平行试验。试验数据采用Microsoft Excel软件进行制图，并利用SPSS Statistics 22软件进行单因素方差分析和显著性t检验，结果通过平均值±标准差表示，P＜0.05为显著性差异，P＞0.05为不显著。

2 结果与分析

2.1 不同红曲菌种发酵最终pH值的对比分析

不同菌种发酵的最终pH值结果见图1。

从图1中可以得出不同红曲菌发酵新鲜红薯产酸的代谢能力差别不显著（P＞0.05），红曲菌GN的产酸能力相对较强，其发酵最终pH值为5.00，红曲菌Z505和红曲菌H4000产酸能力较为接近，分别为5.42和5.32。导致红曲发酵液呈现酸性的主要因素为有机酸，其中，乳酸、乙酸、苹果酸、琥珀酸和酮戊二酸是红曲发酵液中的主要有机酸，占总量的87%左右。红曲菌产酸的能力主要与淀粉酶和糖化酶相关[18]，与培养基中无机盐的种类和添加量也有一定的相关性[19-20]。产淀粉酶以及糖化酶较强的红曲菌能更多地利用底物原料，产生各种初级代谢产物以及次级代谢产物，发酵液中各物质的差异性导致了不同红曲菌在发酵过程中的pH值存在一定差异。其中红曲菌GN的最终pH值低于红曲菌Z505和H4000，可能是由于红曲菌GN能够产生较多的淀粉酶和糖化酶消耗了更多的底物原料所导致的。以农产品为发酵原料时，农产品在发酵过程中具有良好的pH缓冲性[21]。因此，在以新鲜红薯为原料时，不同菌种对发酵最终pH值的影响不明显。

2.2 不同红曲菌种发酵产红曲色素的对比分析

不同的菌株产色素能力不同[22-24]。不同菌种发酵新鲜红薯产红曲色素的结果见图2。

由图2可知，红曲菌GN产红曲色素的能力较强，颜色呈深红色，红曲色价为239.1 U/mL，其红曲红色素、橙色素、黄色素的色价分别为 99.1、55.8、84.2 U/mL；红曲菌H4000产红曲色素的能力相对较弱，颜色呈橘黄色，红曲色价为48.8 U/mL，其红曲红色素、橙色素、黄色素的色价分别为14.8、8.8、25.2 U/mL；红曲菌Z505在这3株红曲菌中产色素能力最弱，颜色呈橙黄色，色价为29.5 U/mL，其红曲红色素、橙色素、黄色素的色价分别为9.4、4.2、15.9 U/mL。红曲色素的质量和产量主要受碳源、氮源、发酵温度、pH值、色素疏水性等因素的影响，此外，菌种的差异性也会导致红曲色素的质量和产量存在较大差异性。周珂等[25]利用紫色红曲菌ZH2液态发酵产生的主要为橙色素和黄色素，其橙色素和黄色素分别为152.96、108.38 U/mL。黎青华等[26]通过诱变育种获得的红曲菌突变株LBBE-15主要产红色素，其红曲红色价达到1 244 U/mL。本试验筛选出的3株红曲菌株的发酵液颜色呈现出不同的颜色，且红曲色价均不同，这是菌种的差异性导致的。因此可以针对不同要求，选用不同的发酵菌种进行不同产品的研发。

2.3 不同红曲菌种发酵产红曲多糖的对比分析

不同红曲菌株发酵新鲜红薯产红曲多糖的结果见图3。

由图3可知，红曲菌菌株Z505、GN与红曲菌菌株H4000产红曲多糖的能力存在显著差异（P＜0.05），其中红曲菌Z505产红曲多糖的能力最强，其红曲多糖的含量为1.89 g/L，其次是红曲菌GN和红曲菌H4000，其红曲多糖含量分别为1.75g/L和1.18g/L。目前通过培养基优化和发酵工艺优化，得到的红曲菌液态发酵产红曲多糖含量一般为1 g/L左右[16]。大部分多糖饮料由于原料来源或制作方法的不同多糖含量差别较大，多糖饮料的含量多为 0.1 g/L～10.0 g/L[5，27-29]。本研究中 3 株红曲菌的红曲多糖含量均达到了1g/L以上，表明这3株红曲菌产红曲多糖能力较强，可进一步优化培养基及其发酵工艺使红曲多糖的产量得到提高。

2.4 不同红曲菌种发酵产桔霉素的对比分析

不同红曲菌株发酵后上清液的桔霉素检测结果见图4。

由图4可知，红曲菌菌株Z505、H4000与红曲菌菌株GN产桔霉素的能力存在显著差异（P＜0.05）。红曲菌GN上清液中的桔霉素浓度为0.45 mg/L，红曲菌H4000上清液中的桔霉素浓度为0.23 mg/L，红曲菌Z505上清液中的桔霉素浓度为0.10 mg/L。有研究报道，可以通过改变发酵培养基中的物理环境因素或添加外源添加物来控制菌丝生长，影响代谢途径，从而达到降低桔霉素的目的[30]。本研究发酵周期为6 d，桔霉素浓度随发酵周期的延长也会发生变化，通过培养基优化以及工艺优化可进一步优化发酵工艺降低桔霉素浓度，使最终红曲多糖发酵饮料中不含有桔霉素。

2.5 不同菌种的感官评分结果

不同红曲菌发酵过滤液的感官评分的结果见图5。

由图5可知，与红曲菌GN和H4000相比，红曲菌Z505的感官评分具有显著性差异（P<0.05），红曲菌Z505的感官评分（83分）最高，这可能是由于红曲菌Z505能够产生较好酸、醇、酯等香味物质；红曲菌GN与H4000的感官评分均为74。通过对比发现红曲菌GN发酵过滤液颜色较深，具有花香但也有较重的异味，所以评分较低；红曲菌H4000颜色偏橘黄色，较为透亮，但有异味，故感官评分较低；红曲菌Z505发酵过滤液虽然颜色较其他两株菌颜色浅，但色正，透亮，且具有怡人的花果香味，因此红曲菌Z505的评分最高。多糖可以通过改变食品质构或者多种作用力与风味物质分子结合来影响风味物质的扩散及保留[6，31]，风味物质与多糖的亲和力越强，越容易发生相互作用，从而越容易得到保留。本试验中由红曲菌Z505发酵得到的胞外多糖为1.89 g/L，其感官评分也相对最高，表明多糖对香味物质的保留以及扩散具有一定的正相关性。

3 讨论与结论

红曲菌产生的红曲多糖可以影响风味物质的释放，使饮料产品具有更好的感官品质，红曲菌发酵还能产生苯乙醇、辛醇、2-壬酮、亚油酸乙酯等风味物质赋予红曲产品良好的风味，除此之外，红曲菌产生的红曲黄色素、橙色素、红色素，能够赋予发酵饮料颜色，产生的monacolin K、γ-氨基丁酸等多种功能活性物质赋予其功能性，红薯是一种营养丰富的食品，所以利用红曲菌发酵红薯制备红薯红曲多糖饮料有一定的前景。

不同红曲菌株产代谢产物的能力存在明显差别，本研究对比分析 3 株红曲菌（Z505、H4000、GN）液态发酵红薯研制多糖饮料在pH值、红曲色素、红曲多糖、桔霉素以及感官评分的差异性，结果表明3株红曲菌发酵结束时的pH值无明显差异，红曲菌株Z505产红曲多糖的能力最强，为1.89 g/L，桔霉素含量最低，发酵上清液色泽橙黄透亮，感官评分最好，散发着花果香味，适合进一步用于红薯红曲多糖饮料方面的研制。