基于耳石不同切面的小黄鱼年龄鉴定及其生长方程年龄反演比较

康中杰，宋大德，李 纲，严利平，仲霞铭，汤建华，王燕平，吴 磊，熊 瑛

（1.上海海洋大学海洋科学学院，上海 201306；2.江苏省海洋水产研究所，江苏南通 226007；3.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部海洋与河口渔业重点开放实验室，上海 200090）

耳石是由生物矿化作用所形成的碳酸钙结晶，耳石上沉积物质显示出每日积累，其在代谢上几乎是惰性的，具有极好的保守性，因此可用来鉴定鱼类的日龄和年龄［1］。对于硬骨鱼类来说，相比其他硬组织（鳞片、脊椎骨、鳃盖等），耳石仍然是最常用、最可靠的年龄鉴定的生物材料［2］。鱼类的年龄与生长一直是鱼类种群动力学参数估算的基础，许多学者运用鱼类耳石的不同切面做了年龄与生长方面的相关研究［3-4］；耳石也被应用于鱼类生长参数估算，大多数生长参数估算方法都是以随着年龄增长的体型增长理论为基础，如最常用的Von Bertalanffy生长方程（VBGF）参数估算方法，那么基于耳石的生长模型估算不同时期鱼类体型的变化为研究鱼类生长提供了一个可行可靠的途径［5］。然而，由于获取耳石切片的相对较高的时间成本和年龄鉴定的难度，基于鱼体体长或体质量指标利用已有的鱼类生长方程来反推鱼体年龄，成为当前年龄估算的一种便捷方法。

小 黄 鱼［Larimichthys polyactis（Bleeker，1877）］属石首鱼科，黄鱼属，为暖温性底层鱼类，分布于我国东海、黄海和渤海以及朝鲜半岛西岸海域［6］。小黄鱼的资源状况一直备受国内外学者的关注，是我国海洋经济渔业资源研究的模式种，在我国海洋渔业资源中占有十分重要的地位［6］。随着对小黄鱼的开发利用，自20世纪90年代起小黄鱼群体年龄结构简单，呈现“低龄化”，多为1～3龄［7］，对这一定性结论的精细化研究却较为少见，而根据近年体长组成特征，间接反映出小黄鱼低龄化状况有所缓解［8］。因此，对小黄鱼年龄进行准确鉴定是研究小黄鱼种群结构必不可少的一项基础性工作。研究者们对石首鱼科大黄鱼（Larimichthys crocea）、小黄鱼、白姑 鱼（Pennahia argentata）、黄 姑 鱼（Nibea albiflora）、棘头梅童鱼（Collichthys lucidus）等开展过年龄研究［9-10］。由于其耳石晶体结构层厚，无法从耳石表面来观察年轮，常以分析单个切面进行年龄鉴定。针对小黄鱼耳石磨片制作，兰永伦和罗秉征［11］曾尝试过从3个不同方向切割小黄鱼耳石以确定最佳切片位置和方向，但并未对小黄鱼耳石轮纹进行比对分析。此外，大部分学者以获取的体长数据通过小黄鱼的生长方程来反演年龄［12-14］，但其反演结果的准确性并未加以验证。

本文以黄海南部小黄鱼矢耳石为研究材料，基于矢耳石纵切面、横切面、水平切面3个切面进行年龄鉴定［1，15］，比较3个切面判读年轮的效果，同步系统地归纳我国近30年来小黄鱼的生长方程以进行年龄反演，通过二者年龄鉴定结果的比对，总结小黄鱼年龄鉴定和估算的关键点，提出鱼类年龄研究的科学性、合理性的建议，以期为渔业资源管理积累基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本研究随机选取小黄鱼样本共计45尾，分别于2018年4月在黄海南部的吕四渔场（121°40＇E～121°50＇E、32°10＇N～32°20＇N）采集小黄鱼15尾，于2019年9月在大沙渔场（122°40＇E～122°50＇E、33°40＇N～33°50＇N）采集小黄鱼30尾。小黄鱼样品冷冻保存后运输至实验室进行生物学测定，主要测体长（standard length，SL）（精确至1mm）、体质量（body weight，BW）（精确至0.01g）等参数。用镊子摘取矢耳石作为年龄鉴定材料，去除表面杂质，用酒精清洗、干燥后，编号保存在离心管中。其中，4、9月分别取5、10尾小黄鱼的耳石用于纵切面、水平切面、横切面切片分析（表1）。

表1 小黄鱼耳石3个切面样本资料Tab.1 Sampling details of L.polyactis in three sections（mean±SD）

1.2 耳石切片制作

根据小黄鱼耳石切面示意图（图1）并参考熊瑛等［16］的方法制作耳石切片，但其中部分制作过程略有调整。首先，将A胶和B胶按照1∶1体积比涂在锡箔纸上用酒精灯微微加热充分搅拌混合，点滴于镶样杯杯底，耳石按不同切面水平放于AB胶上30 min，待耳石固定后用环氧冷镶嵌溶液［树脂和硬化剂（质量比为1∶7），丹麦Struers公司］包埋，置于37℃烘箱中干燥12 h。然后，用DTQTM5低速精密切割机切去多余的树脂，用热熔胶将其固定于标准载玻片上研磨。研磨过程中先用P500的SiC砂纸粗磨至耳石核心即将暴露，再用P2000的SiC砂纸精磨至耳石核心，最后换用装有MD-Chem抛光布的磨抛机（RotoPol-35，丹麦Struers公司）辅以0.25μm OP-S抛光液抛光。如此完成一面，将耳石切片另外一面重复上述操作步骤，直至核心完全暴露。

图1 小黄鱼耳石切面示意图Fig.1 Schematic diagram of the otolith sections for L.polyactis

1.3 年龄读取

本研究采用直接读取和酸蚀后读取轮纹两种方式进行。将耳石切片置于5%的EDTA进行酸蚀［3］，每隔1 s取出，用去离子水清洗、拭干，并在反射光下和透射光下切换观察，直至能在金相显微镜下获得清晰年轮带。

所有耳石切片制作好后在金相显微镜下观察并拍照。由于耳石切面面积较大，拍摄单张照片无法显示完整的耳石面，故先将耳石含轮纹的各部分拍成照片后，使用S-gauge软件拼接出成完整轮纹照片，以分析年轮。

耳石年龄读取，采用CAMPANA和NEILSON［17］的方法，在不清楚样本大小、性别的情况下，每个耳石切片分别由三人读取并记录，取三人读取结果的平均值纳入后续的处理。参考PAUL和HORN［18］的方法，对小黄鱼耳石3个切面年轮的清晰度按照等级进行评分：1）“非常好”（轮纹清晰，年轮直观）；2）“一般”（轮纹较为清晰，经仔细确认后可以辨别）；3）“难以辨认”（轮纹模糊，年轮辨别困难）。

1.4 生长方程年龄反演

通过系统整理近30年来探究小黄鱼年龄与生长的VBGF文献，得出19个VBGF［12-14，19-33］（表2），用于对本文45尾小黄鱼的年龄反演。Von Bertalanffy生长方程为：

表2 渤海、黄海、东海小黄鱼Von Bertalanffy生长方程Tab.2 Von Bertalanffy grow th equation of L.polyactis in Bohai Sea（BS），Yellow Sea（YS），and East China Sea（ES）

式中，Lt表示生物体在t龄时的体长；L∞表示生物体的渐进体长，也称极限体长或最大体长；t0表示理论上体长（Lt）等于零时的年龄，是一个假定的理论常数；K为生长曲线的平均曲率，表示趋近渐进值的相对速度。

采用单因素方差分析（ANOVA）对生长参数K和L∞进行统计检验，从而解释不同生长方程参数的差异性。统计分析采用SPSS 23.0软件，当P＜0.05时，认为差异显著。

理论上，因取样区域源自黄海南部，可假设其样本归属于南黄海族种群，其产卵高峰期在每年的4月［7］，因此，默认本研究4月份采集的小黄鱼年龄测记依次为1龄、2龄、……，9月份采集的小黄鱼（5月龄≈0.417龄）年龄测记依次为1.417龄、2.417龄、……。

分别以3个耳石切面鉴定得出的年龄与不同生长方程得出年龄相比对，计算出方程与各切面比对的相似度，即表中年龄测记与生长方程计算结果相同（当年龄反演结果为1.00～1.99时，认为与1龄和1.417龄是相同；当年龄反演结果为2.00～2.99时，认为与2龄和2.417龄是相同）的个数在总数中所占比例，进而得出最吻合的生长方程，公式如下：

2 结果与分析

2.1 矢耳石3个切面特征

在金相显微镜下观察，小黄鱼耳石切片中心核呈圆形，核内深黑色的圆形结构为耳石原基。反射光下耳石切片上呈现明暗交替的环带现象，明带（不透明带）与暗带（半透明带）之间是一种渐变的过渡。明暗交替的轮纹作为读取年龄的标志，即一条明带和暗带共记作1龄。

2.1.1 纵切面

小黄鱼耳石纵切面切片（图2）形状为不规则椭圆形，前端较宽，后端较窄。耳石核心靠近背端，在年轮排列区域，由耳石核心到边缘年轮间距呈现有规律的缩短，靠近中心核的轮纹间距较大，靠近边缘的轮纹间距显著变窄。由耳石中心核到边缘，轮纹由圆环状逐渐变为椭圆状。随着轮纹的增加，轮纹逐渐呈现为无规律、不规则曲线状，这一现象同样出现于水平切面和横切面上。纵切面在未酸蚀的情况下不易分辨年轮，较另外两个切面具有更多的干扰轮纹，易使年轮读取产生偏差，使鉴定结果偏大（图2）。酸蚀之后，年轮带相对明显（图3）。

2.1.2 水平切面

小黄鱼耳石水平切面（图2，图3）核心至边缘轮纹逐渐增多，轮纹形状不规则。水平切面核心区域由轮纹密集而形成的最长轴，在进行年龄鉴定时，只观察长轴上缘的年轮带不足以准确鉴定年轮数量，需要借助长轴下缘年轮带矫正，但少数切片的长轴下缘年轮不清晰，干扰轮纹较多，难以分辨，导致年龄鉴定效果不好。由于水平切面核心区域面积较小，在研磨时较难掌握切片厚度，导致在透射光下亮带与暗带较难区分且无法观察到核心区域。因此，在观察水平切面年轮时应尽量使用反射光观察。水平切面酸蚀之后，年轮带更为明显。

2.1.3 横切面

小黄鱼耳石横切面（图2，图3）在研磨过程中，不易磨至核心区域。当以横切面为截面观察年轮时，年轮暗带和明带分界清晰，较易观察，在反射光下能清晰辨别出年轮带，核心周围区域几乎没有干扰轮纹，大多数切片无需酸蚀可观察到年轮。横切面切片由核心区域到边缘的轮纹形状由平滑的曲线变为不连续曲线或折线，轮纹宽度不一且波动较大。针对横切面，建议尽量使用反射光边研磨边观察年轮情况。酸蚀之后，年轮带也更为明显。

图2 反射光下小黄鱼耳石3个切面及年龄标记（未酸蚀）Fig.2 Age signs on three sections of otolith for L.polyactis under reflected light（no acid etching）

图3 反射光下小黄鱼耳石3个切面及年龄标记（酸蚀）Fig.3 Age signs on three sections of otolith for L.polyactis under reflected light（acid etch）

2.2 矢耳石3个切面清晰度评分比较

对小黄鱼矢耳石3个切面轮纹清晰度评价结果（表3）显示，横切面轮纹的清晰度最高，被判断为“非常好”的比例高达73.33%；其次是水平切面，被判断为“非常好”的比例达66.67%；而纵切面被判断为“一般”和“难以辨认”的比例近乎50.00%。

表3 小黄鱼耳石3个切面的清晰度评分Tab.3 Distribution of readability scores for three otolith sections of L.polyactis

2.3 生长方程年龄反演与年龄鉴定比对

基于VBGF方程年龄反演结果详见表4。用单因素方差分析法对渤海、黄海及东海海域的生长参数K、L∞进行差异分析，结果表明，K值差异性显著（P＜0.05）、渐进体长L∞无显著差异（P＞0.05）。将生长方程计算结果与年龄测记对比之后分别得出纵切面、水平切面、横切面的相似度。在纵切面相似度中，生长方程Lt＝366［1-e-0.11777（t+1.76429）］和Lt＝230［1-e-0.26（t+0.3678）］反演结果的相似度比较高，分别为53.33%和66.67%。在水平切面相似度中，生长方程Lt＝206.827［1-e-0.45413（t+0.3534）］反演结果的相似度为66.67%，生长方程Lt＝366［1-e-0.11777（t+1.76429）］反演结果的相似度为86.67%，其他生长方程均在50.00%以下。在横切面相似度中，生长方程Lt＝206.827［1-e-0.45413（t+0.3534）］反演结果的相似度 为80.00%，生 长 方 程Lt＝366［1-e-0.11777（t+1.76429）］反演结果的相似度为86.67%。由于生长方程Lt＝206.827［1-e-0.45413（t+0.3534）］的研究中采用的样本数仅100尾，可能会因样本量较少而导致本实验中年龄反演结果不准确，故排除。Lt＝230［1-e-0.26（t+0.3678）］反演结果的水平切面和横切面的相似度较低，也可排除。由此得出，黄海及东海小黄鱼的生长方程Lt＝366［1-e-0.11777（t+1.76429）］的年龄反演结果，与本实验中小黄鱼年龄最吻合。结合清晰度评分，故可排除纵切面作为小黄鱼的年龄鉴定最佳切面。

表4 小黄鱼生长方程年龄反演结果与不同切面年龄相似度对照表Tab.4 Sim ilarity com paring table of age backward inferring results of grow th equations w ith age determ ination from three otolith sections for L.polyactis

3 讨论

3.1 3个切片特征比较

年龄鉴定在渔业资源评估、渔业管理和资源的合理开发中具有重要作用，高估或低估年龄都可能会造成资源的过度开发或浪费，而鱼类耳石年轮的清晰度会影响鱼类年龄鉴定的准确性。本文对耳石不同切面清晰度评分中显示，横切面的清晰度最高，年龄鉴定效果最好。分析其原因为，横切面较其他切面表面积较小，易观察，同时受次生核影响较小，在研磨过程中即使切片过薄也不易导致年轮带不清晰。

耳石切片上的年轮表现为明暗交替的环带现 象，这 与 丁 城 志 等［34］在 描 述 孔 吻 鲃（Poropuntius huangchuchieni）耳石年轮特征时一致。耳石年轮的形成是由于环境因素和鱼类内源机制的共同作用［17，35-36］。春夏季节鱼类摄食活动旺盛，生长速率快，碳酸钙堆积在耳石的量增多，耳石形成半透明带，秋冬季节由于光照减弱导致水温低，摄食活动和生长速率有所降低，碳酸钙堆积速度变慢，耳石形成不透明带［1］。切片轮纹由核心区域至边缘的变化对应到具体的耳石形态变化过程为，从小黄鱼矢耳石早期的圆形到后期的近椭圆形且表面有不规则疣状突起，原因可能是与小黄鱼幼鱼到成鱼的生长发育有关［37］。这种变化也出现在多数鱼类上，如姜涛等［3］发现刀鲚（Coilia nasus）矢耳石从早期的圆形变化至后期前端分叉的纺锤形，严太明等［38］发现骨唇黄河鱼（Chuanchia labiosa）矢耳石由早期的圆形发育为后期的箭矢状。

纵切面切片表面积较大，这有利于运用耳石微化学最大化地反映小黄鱼全生活史［39-40］。纵切面切片核心周围区域干扰轮纹较多，会对小黄鱼幼鱼日轮的判断产生影响。干扰轮纹的产生可能是由于次生核的影响，而次生核形成原因与仔鱼向稚鱼的变态发育有关，仔鱼期生长率快的个体，其次生核数量可能越多［41］。耳石的轮纹特征不仅可以反映个体发育过程以及栖息环境变化等状况［42］，还可以用于鉴别不同地理群系小黄鱼［43-44］，这种方法已见于对大西洋鲱（Clupea harengus）等鱼类的研究［45］。

在研磨过程中，水平切面的年轮带较易观察，在不酸蚀的情况下大多数耳石也能观察到年轮（图2），因此适宜做年龄鉴定。水平切面也可以用来研究小黄鱼耳石微结构从而判断日龄和生长状况［9］。水平切面靠近核心区域的轮纹部分密集，其最长轴更有利于耳石微化学分析。

横切面适宜作为年龄鉴定的最佳切面。这与姜涛等［3］和刘子俊等［4］在研究刀鲚和次南极电灯鱼（Electrona carlsbergi）的结论一致。小黄鱼横切面几乎无次生核，也可观察仔、稚鱼日龄并进行生长分析。胡海生等［10］在制作小黄鱼横切面切片时将耳石横切为厚度0.5 mm的薄片，这种方法较易磨至耳石核心区域，但要掌握好耳石切割位置。

3.2 生长方程年龄反演

本研究中生长方程的年龄反演以水柏年［32］研究最具代表性，其方程反演的年龄与样本小黄鱼3个切面鉴定的年龄相似度均最高。其可能原因分析如下：首先，水柏年［32］实验样本包括黄海、东海海域的小黄鱼，其样本的区域性与本研究样本区域是基本重叠的，这可能是其相似度较高的原因之一。其次，水柏年［32］采用一元线性回归方法拟合的生长方程预测准确率较高；鉴于目前小黄鱼种群结构单一的现状仍未改变，如果使用Ford-Walford生长变换法会导致生长参数科学性不高［12］，这一论点在严利平等［33］研究中有所证实。严利平等［33］认为，使用逆算体长以Ford-Walford生长变换法和非线性回归方法两种方法来拟合生长方程，结果表明非线性回归方法较Ford-Walford生长变换法有较好的拟合。第三，水柏年［32］实验中生长指标不仅包括鱼体长和纯重，而且以耳石作为拟合生长方程的年龄鉴定材料，这也是其方程相似度较高的重要原因。此外，本研究中也出现了一些研究者的方程反演结果与鉴定结果偏离较大的情况。如LIU等［22］生长方程反演年龄较其他结果偏大，其原因可能是在计算t0时只是将其代入PAULY［46］的经典公式而并未进行修正，由此产生较大误差；不同区域小黄鱼的生长发育状况不同或是本身属于不同的种群，这也可能是导致其生长方程反演年龄与年龄鉴定相似度较低的原因之一。需要指出的是，许多鱼类的生长方程拟合仅采用体长或体质量频率分布法，如本研究中所涉及的小黄鱼生长方程利用耳石、鳞片等年龄材料做辅助拟合的研究较少，而单一方法拟合得出的生长方程准确性也还有待验证；同时，拟合生长方程时，可考虑运用多种方法、多重比较，进而选择更优的拟合方法。因此，在以鱼体体长或体质量作为参数推断鱼类年龄时不能简单地选择生长方程进行反演，不仅要考虑取样时间、海域等差异性，还应结合鱼类年龄印证结果和生长方程拟合方法择优选择。

同样，年龄反演结果还受制于该生长方程模拟时的样本选取。在取样时，样本量并非越多越好，关键在于个体大小范围，成体和幼体均应有一定数量。但由于样本数量的要求以及采样可能导致鱼类死亡等问题，这些生长数据的获取所需要的时间成本是不容忽视的，生长方程是基于各类体型范围的个体大小的数据进行拟合以得到最优的生长方程参数拟合结果［5］。对于小黄鱼而言，雌性个体往往比雄性个体稍大［8］，应尽量将雌、雄鱼分别计算生长方程，以此来避免雌雄鱼体长和体质量的不同所导致的误差。在本次取样中有体长为100 mm以下的雌性小黄鱼已达到性成熟，而所有生长方程反演年龄不满1龄，由此验证了水柏年［32］提出的小黄鱼性成熟提前的现象，同时也间接说明生长方程反演结果无法覆盖特殊个体。年龄反演作为鱼类年龄鉴定和生长研究中重要的研究手段，在反映生物资源量及种群结构动态变化上有着极其重要的意义，基于小黄鱼的年龄反演研究还有待继续开展。

此外，年龄鉴定材料和方法在研究鱼类年龄和年龄反演中也尤为重要。就同一种鱼而言，不同的年龄鉴定材料上的年轮的清晰程度和数目不一定是相同的，且不同年龄段的鱼的年龄鉴定最适材料也可能是不一样的［47］。目前小黄鱼年龄鉴定材料中，耳石是应用最广泛的材料，鳞片也可作为年龄材料，金显仕［19］借助鳞片作为辅助拟合生长方程。另外，脊椎骨还被应用在大眼金枪鱼（Thunnus obesus）和大黄鱼的年龄鉴定上［47-48］。不同的鱼类其理想的鉴定材料也不同，所以在条件许可时往往需要通过多种材料进行鉴定并比较其优劣。刘艳超等［49］研究双须叶须鱼（Ptychobarbus dipogon）利用微耳石、星耳石、脊椎骨、鳃盖骨、臀鳞、胸鳞、侧线鳞和背鳞等8种年龄材料分析比较，从而选择最适材料。小黄鱼不同年龄段的年龄鉴定最适材料还有待进一步研究，作为除耳石和鳞片之外的补充材料，为以后小黄鱼的年龄鉴定提供参考依据。关于年龄鉴定，年轮检视常是最有效的方法［50］之一。但这种方法也存在主观性等缺点，尽管有学者认为边际增量分析是对年龄鉴定的极好补充［2］，但是这种方法的适用性和精确性等还有待证实。

耳石被广泛用于研究鱼类的种群结构和生长特征［51-52］，年龄鉴定的可靠性至关重要。尽管小黄鱼资源小型化、低龄化的问题有所改善，但其种群结构简单化的问题依然严峻。因此，有必要加强小黄鱼年龄鉴定的基础性研究和种群动力学科研攻关，确保我国小黄鱼渔业资源的可持续利用。