欧洲鳗鲡RIG-I基因的克隆、序列特征分析与原核表达

李英英，陈 曦，杨金先，陈 强，宋铁英，葛均青

（1.福建省农业科学院生物技术研究所，福州 350003；2.福建省养殖动物营养与新型饲料企业工程技术研究中心，福州 350003）

维甲酸基因I（retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）与黑色素瘤分化相关基因5（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5）、实验遗传和生理基因2（laboratory of genetics and physiology 2，LGP2）都属于RIG-I样受体（RIG-I like receptors，RLRs），是DExD／H box RNA解旋酶家族的成员［1］，可识别病原微生物表面的病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），与下游接头分子结合，产生信号级联放大效应，激活宿主的天然免疫信号通路，诱导干扰素（IFN）和促炎因子等抗病毒效应分子的表达［2-3］。RIG-I和MDA5的结构和功能类似，N端都有两个串联的半胱天冬酶富集结构域（CARD），是病毒RNA的胞质传感器，在病毒入侵时识别病毒mRNA并启动RIG-I样受体与其特定的配体结合，诱导机体产生IFN和炎症因子，抵御病毒侵袭［4］；LGP2的N端缺少CARD结构域，不能传递病毒识别信号，但其对RLR信号通路有调控作用［5-8］。尽管RIG-I和MDA5的结构和功能都类似，但RIG-I偏向于识别短链dsRNA和5＇PPP dsRNA［9］，未被dsRNA刺激时处于自抑制状态［10］；而MDA5偏向于识别长链dsRNA，未发现其存在自我抑制的状态［11］。RIG-I既可识别RNA病毒，也可识别DNA病毒；而MDA5仅可识别RNA病毒［12］。因此，在DNA病毒侵染宿主的过程中，RIG-I及其介导的免疫反应在宿主抗病毒免疫应答中发挥重要作用。

鳗鲡属（Anguilla）鱼类是我国重要的经济鱼类，其产值在水产品出口贸易中占有重要地位。随着集约化养殖的发展，鳗鲡养殖期间病害频发，给业者造成巨大的经济损失，严重阻碍行业的健康发展。鳗鲡“脱黏败血综合征”是养殖鳗鲡幼鳗期高发的传染性疫病，病鳗主要出现“红头”、“脱黏”和“败血”等症状。前期研究中，利用鳗鲡卵巢细胞系（eel ovary cell line，EO）从患“脱黏败血综合征”病鳗体内分离出鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus，AngHV）［13］，证 实 了AngHV是鳗鲡“脱黏败血综合征”的致病病原［14］。

AngHV是疱疹病毒目（Herpesvirales）鱼蛙疱疹病毒科（Alloherpesviridae）鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus）的线性双链DNA病毒。前期的蛋白质组学分析和进一步的qPCR验证结果表明，感染AngHV后，鳗鲡皮肤黏液的RIG-I基因及其介导的RLRs信号通路上的多个基因被激活。本研究设计引物，从欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）体内克隆出RIG-I基因，对其进行生物信息学分析，并在大肠杆菌内表达了RIG-I基因，以期为后期制备RIG-I多克隆抗体和进一步探索RIG-I介导的天然免疫在鳗鲡抵御AngHV侵染过程中的作用机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验鳗鲡为福建省农业科学院生物技术研究所实验室内养殖群体。2×Phanta Max Master Mix、5min TA／Blunt-Zero Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，PrimeScriptTMII 1stStrand cDNA Synthesis Kit、DNA Marker购自宝日医生物技术（北京）有限公司，胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 组织总RNA提取及cDNA合成

取欧洲鳗鲡的内脏组织（肝脏、脾脏和肾脏），Trizol法提取总RNA，超微量紫外分光光度计测定其浓度和纯度；每个样品取500 ng RNA，用PrimeScriptTMII1stStrand cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA，-20℃保存备用。

1.2.2RIG-I基因的克隆

根据前期转录组测序获得的欧洲鳗鲡RIG-I基因mRNA序列，用DNASTAR lasergene V7.1设计特异性扩增欧洲鳗鲡RIG-I基因的引物对：RIG-I RW（ACCGGGGACGCGTTGAGTAAGC）和RIG-I FW（TATCCAAAGCGACGAGTGTGAAGC）。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶纯化回收目的片段。将目的片段克隆至pCE2-TA／Blunt-Zero载体，用PCR鉴定后选取阳性菌株，进行测序验证。

1.2.3RIG-I基因序列的生物信息学分析

用DNASTAR lasergene V7.1分析查找扩增片段中的ORF序列，利用NCBI的BLAST在线工具对扩增获得的序列进行同源性分析（https：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi？PROGRAM＝blastn＆PAGE_TYPE＝BlastSearch＆LINK_LOC＝blasthome）；用Protparam分析核苷酸及氨基酸序列的组成成分和理化性质（http：／／web.expasy.org／protparam／）；用TMHMM2.0分析预测蛋白质跨膜结构域（https：／／services.healthtech.dtu.dk／service.php？TMHMM-2.0）；用SignalP-5.0分析预测蛋白信号肽结构（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）；用PSORT IIPrediction进行亚细胞定位（http：／／psort.hgc.jp／form2.html）；用HNN预 测 蛋 白 质 二 级 结 构（http：／／npsa-pbil.ibcp.fr／cgi-bin／npsa_automat.pl？page＝／NPSA／npsa_hnn.html）；用CDD分析基因蛋白保守功能结 构 域（https：／／www-ncbi-nlm-nih-gov.frodon.univ-paris5.fr／Structure／cdd／wrpsb.cgi）。

1.2.4 表达质粒的构建

根据测序得到的欧洲鳗鲡RIG-I基因序列（GenBank序列号：ON873727），在其ORF序列前端添加NdeⅠ酶切位点、ATG起始密码子和His tag，在末端添加终止密码子及HindⅢ酶切位点（NdeⅠ--ATG--His tag--RIG-I--Stop codon--HindⅢ，Protein Length＝947），合成该序列后克隆至pET-30a载体，提取质粒后双酶切鉴定，获得30a-RIG-I表达质粒。

1.2.5RIG-I基因的诱导表达

将质粒30a-RIG-I转化至感受态E.coliBL21（DE3）细胞，挑选阳性克隆，接种于LB液体培养基中。37℃、200 r·min-1培养至OD为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG，置于15℃培养16 h。离心收集细菌菌体，超声破碎后分别取细胞裂解液、裂解液上清和裂解液沉淀进行SDS-PAGE分析。

1.2.6 表达RIG-I的western blot验证

取诱导后的裂解液上清液进行SDS-PAGE电泳［设置Multiple Tag（Purified）（南京金斯瑞生物科技有限公司）作为His-Tag阳性对照］，半干法转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液37℃封闭1 h，TBST缓冲液洗膜后，置于1∶3 000倍稀释于TBST中的鼠抗His-Tag单克隆抗体（英国艾博抗生物技术有限公司）室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜后，置于1∶15 000倍稀释于TBST缓冲液中的HRP标记的羊抗鼠IgG（美国Cell Signaling Technology，CST）室温孵育1.5 h，TBST洗膜后，采用Super ECL Plus化学发光液（北京兰博利德生物技术有限公司）显色，用ChemiScope 6000 Touch成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）拍照。

2 结果与分析

2.1 欧洲鳗鲡RIG-I基因的克隆

设计引物对RIG-IRW／RIG-IFW，利用PCR从合成的欧洲鳗鲡cDNA中扩增出约3 361 bp的条带（图1），克隆至pCE2-TA／Blunt-Zero载体后测序，经BLAST比对分析，证实成功克隆了欧洲鳗鲡的RIG-I基因。

图1 欧洲鳗鲡RIG-I基因的PCR扩增Fig.1 PCR amp lification of Anguilla anguilla RIG-I

2.2 欧洲鳗鲡RIG-I基因的生物信息学分析

DNASTAR lasergene V7.1分析表明，欧洲鳗鲡RIG-I基因的ORF序列长度为2 823 bp碱基，编码940个氨基酸；Blast的结果表明，欧洲鳗鲡RIG-I基因与GenBank中日本鳗鲡（A.japonica）RIG-I基因的序列（MK838769.1）同源性为96.71%，有93 bp碱基发生点突变，对应52个氨基酸发生点突变（图2）。

图2 欧洲鳗鲡RIG-I的基因和氨基酸序列Fig.2 Gene and am ino acid sequence of Anguilla anguilla RIG-I

Protparam分析显示，欧洲鳗鲡RIG-I蛋白分子量约为108 kDa，等电点为6.31，属酸性蛋白；不稳定系数为42.58，较不稳定；总平均亲水性系数为-0.487，属亲水性蛋白；不存在跨膜结构；无信号肽。亚细胞定位显示，65.2%位于细胞质，21.7%位于细胞核，8.7%位于细胞骨架，4.3%位于过氧化物酶体。HNN预测结果显示，RIG-I蛋白的二级结构中α-螺旋（alpha helix）占47.55%，延伸链（extended strand）占15.11%，无规则卷曲（random coil）占37.34%。CDD分析结果表明，RIG-I蛋白有6个保守功能区，其在氨基酸序列上的位置及所属蛋白家族如表1所示，2～91 aa和102～190 aa属于DD超家族，254～456 aa属于DEAD-like_helicase_N超家族；621～755 aa属于DEAD-like_helicase_C超家族；471～604 aa和819～932 aa属于不同的RIG-I_C家族。

表1 欧洲鳗鲡RIG-I蛋白的CDD分析结果Tab.1 CDD analysis of Anguilla anguilla RIG-I

2.3 欧洲鳗鲡RIG-I基因的原核表达

将添加了酶切位点和His-tag的RIG-I基因的ORF序列克隆至pET-30a载体，用NdeⅠ／HindⅢ进行双酶切（图3），结果出现约2 844 bp的特异性条带，表明成功构建表达质粒30a-RIGI。将质粒30a-RIG-I转化至E.coliBL21，IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析，结果显示，与未经诱导的载体相比，经15℃诱导16 h后在全菌、裂解液上清和裂解液沉淀约108 kDa处均出现明显的蛋白条带，与预期欧洲鳗鲡RIG-I蛋白大小一致，且在细胞裂解液沉淀中的蛋白含量明显高于上清，说明该蛋白可溶性较差，主要分布于包涵体内（图4-a）。进一步的western blot分析显示，含原核表达质粒30a-RIG-I的诱导菌体可被His-Tag单克隆抗体特异性检测出约108 kDa的蛋白条带，这与表达蛋白的预期大小一致，而His-Tag对照检测到的蛋白大小约为40 kDa（图4-b），表明实现了欧洲鳗鲡RIG-I基因在E.coliBL21（DE3）中的表达。

图3 质粒30a-RIG-Ⅰ的酶切鉴定Fig.3 Restriction enzyme digestion of plasm id 30a-RIG-Ⅰ

图4 SDS-PAGE和western blot分析欧洲鳗鲡RIG-I基因在大肠杆菌中的表达Fig.4 SDS-PAGE and western blot analysis of the expression of Anguilla anguilla RIG-I in E.coli

3 讨论

相较于哺乳动物，鱼类的获得性免疫系统分化不完全［15］，其抵御病原侵袭更依赖其天然免疫系统。大量研究表明，病毒侵染时，RIG-I介导的天然免疫在鱼类抵御病毒侵袭的过程中发挥着重要作用［12］，CHEN等［16］的研究发现，在神经坏死病毒（nervous necrosis virus，NNV）侵染斑马鱼的过程中，RIG-I被激活并特异性的介导II型IFN-I的产生；LIU等［17］通过转录组和蛋白质组联合分析发现，Ⅱ型鲤疱疹病毒（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）感 染 银 鲫（Carassius auratus gibelio）后，RIG-I及其介导的信号通路内的调节因子会被激活。前期研究中，通过蛋白质组分析发现，感染AngHV的欧洲鳗鲡体内RIG-I蛋白表达量显著上调，其介导的天然免疫信号通路上的多个基因也被激活，表明鳗鲡抵御AngHV侵染的过程中，RIG-I介导的天然免疫发挥着重要作用。FENG等［18］和HUANG等［19］均克隆鉴定了日本鳗鲡的RIG-I基因，但二者鉴定到的两个日本鳗鲡RIG-I基因亚型AjRIG-I和AjRIG-Ib同源性仅为39%，本文鉴定到的欧洲鳗鲡RIG-I基因与AjRIG-Ib的同源性达到96.71%，仅部分碱基发生点突变，而与AjRIG-I的同源性较低，该结果可为研究鳗鲡RIG-I基因提供参考资料。

生物信息学分析结果表明，RIG-I蛋白主要位于细胞质中，较不稳定，该结果与此前报道的RIG-I是病毒RNA胞质传感器［4］，未被dsRNA刺激时处于自抑制状态［10］相一致。哺乳动物RIG-I蛋白一般有4个保守功能区，从N端到C端依次为：两个串联的CARD结构域，DEx D／H-box类RNA解旋酶结构域和C端结构域（CTD）。CDD预测结果中，欧洲鳗鲡RIG-I蛋白有6个保守功能区，从N端开始，前两个均属于DD超家族，第三和第五个分别属于DEAD-like_helicase_N超家族和DEAD-like_helicase_C超家族，第四个和第六个属于不同的RIG-I_C家族。DD超家族是蛋白质互作模块中最大的一类，在细胞凋亡、坏死和免疫细胞信号通路中发挥着关键作用，包含4个亚科：DD，death effector domain（DED），CARD和pyrin domain（PYD）［20］。CARD_RIG-I_r1（cd08816）和CARD_RIG-I_r2（cd08817）两个结构域均属于DD超家族中的CARD亚科，表明欧洲鳗鲡RIG-I蛋白与哺乳动物的RIG-I蛋白类似，在N端也有两个串联的CARD。欧洲鳗鲡RIG-I蛋白的C端具有CTD结构域，属于RIG-I_C家族；但预测的结果中，欧洲鳗鲡RIG-I蛋白DEAD-like_helicase_N端结构域和一个DEADlike_helicase_C端结构域之间还有一个结构域属于RIG-I_C家族，该结构域与C端的CTD结构域属于不同的RIG-I_C家族，该结构对欧洲鳗鲡RIG-I蛋白的功能有何影响，有待进一步的研究验证。