尖翅燕鱼染色体核型分析

高 杰，郭华阳，刘明鉴，朱克诚，刘宝锁，张 楠，郭 梁，刘 波，张殿昌，3，4

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广州 510300；2.河北农业大学海洋学院，河北秦皇岛 066003；3.三亚热带水产研究院，海南三亚 572019；4.广东省海洋生物种业工程技术研究中心，广州 510300）

尖翅燕鱼（Platax teira）又称长蝙蝠，为在热带和温带海岸附近生存的海水鱼，属鲈形目（Perciformes），鲈 亚 目（Percoidei），白 鲳 科（Ephippidae），燕鱼属［1］，在阿拉伯海、印度尼西亚到日本海等热带和温带开放水域均有发现。它们主要生活在水深20 m以内的水域。其性情温顺，游动缓慢，属于杂食性动物，主要食物来源为藻类和小型底栖无脊椎动物。作为新兴的养殖品种，该鱼在幼年时形态奇特，可以作为观赏鱼；而其成鱼肌肉蛋白含量高、肉质鲜美，市场潜力巨大。随着人工繁育技术的发展，在中国海南和东南亚诸多国家均实现了人工繁育及养殖，已成为深海网箱养殖最有发展潜力的鱼类之一。目前有关尖翅燕鱼的研究多集中于发育生物学［1］和形态学［2］等方面，在遗传学方面尚未见相关报道。

染色体是遗传物质的载体，可以从其数目和形态来判断物种的进化程度，在鱼类遗传学中起着重要的作用［3］。染色体核型主要由染色体长短臂、臂比、染色体相对长度等组成，某一机体体内染色体可通过相机拍摄的方式，获得其相对恒定的染色体图像。鱼类染色体有数量多、个体小、拍摄难度大等特点，致使研究进展相对缓慢。近年来，对鲈形目鱼类染色体研究较多，但染色体形态数目不尽相同。本研究通过对尖翅燕鱼的染色体核型特征进行研究，旨在为尖翅燕鱼系统分化、进化地位等提供基础信息，同时为尖翅燕鱼育种工作提供细胞遗传学等方面的理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验于2021年7月在中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地进行，共取8尾4月龄的尖翅燕鱼用于染色体核型分析，体质量（30.56±2.37）g，体长（12.70±0.59）cm。采集实验样品后为防止尖翅燕鱼发生应激反应，暂养2 d待鱼体稳定后再进行实验，养殖过程中水温27～30℃，pH 8.2～8.4，溶氧5.0～5.5 mg·L-1，盐度30‰，氨氮含量＜0.02 mg·L-1，亚硝酸盐含量＜0.005 mg·L-1。

1.2 染色体标本制备

实验参照林义浩等［4］肾细胞直接制片法，并略加改进：1）实验鱼分为两组，每组4尾，第1组将实验用鱼进行麻醉，从实验鱼背鳍基部注射植物血凝素（phytohaemagg lutinin，PHA）溶液（0.75% NaCl配制浓度为2.5 mg·mL-1），剂量按鱼体质量15μg·g-1注射，注射后20 h进行第2次PHA注射，注射部位与剂量同第1次。第2次注射PHA 5 h后在同一部位注射秋水仙素溶液（0.75% NaC1配制浓度为125 mg·mL-1），剂量按鱼体质量2.5 mg·g-1注射。第2组使用不同组织浸泡法［3］，直接剪去鳍条和鳃组织，置于250 mg·mL-1秋水仙素溶液中浸泡40 min后备用。2）第1组断尾失血：注射秋水仙素溶液3 h后把实验鱼剪尾放血10 min，鱼死前取出头肾，用生理盐水反复洗涤。3）制备细胞悬液：将组织块置于装有少许生理盐水的培养皿中，两手各持1把镊子，分别将头肾、鳃丝和鳍条反复拉撕分散组织，加入生理盐水，用250目尼龙纱绢过滤。4）低渗处理：0.075 mol·L-1KC1低渗处理30 min。5）固定：在低渗液中加少许固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1，体积比），用吸管吹打进行预固定，随后离心8 min，弃上清液，加固定液，离心，重复2次。6）滴片：将细胞悬浮液滴于事先在4℃冰箱预冷的载玻片上，马上在酒精灯上过火。自然干燥后用10% Giemsa染液染色30 min，蒸馏水缓慢冲洗，自然干燥后置于LEICA DM4000B显微镜下观察拍照。

1.3 染色体核型分析

在显微镜下观察染色体制片并拍照，选择分散均匀、长度适中、形态明确的分离相进行镜检。用Photoshop CS6软件对染色体进行分析，染色体的数量是根据众数原则来计算的［5］。确认着丝点的位置，测量和计算每条染色体的相对长度和臂比，并根据LEVAN等［6］的标准对它们进行配对。根据臂比将染色体分为4组。1）中部着丝粒染色体（metacentric chromosomes，m），臂比为1.0～1.70；2）亚 中 部 着 丝 粒 染 色 体（submetacentric chromosomes，sm），臂比为1.71～3.00；3）亚端部着丝粒染色体（subtelocentric chromosomes，st），臂比为3.01～7.00；4）端部着丝粒染色体（telocentric chromosomes，t），臂比≥7.00。m和sm染色体的臂数为2，t和st染色体的臂数为1。相对染色体长度＝（1条染色体的长度×2／所有染色体的总长度）×100。

2 结果与分析

2.1 尖翅燕鱼染色体数目

镜检共获得110个分散良好的染色体并对其进行计数（表1），其中95个分裂项（占比86.36%）有48条染色体，11个分裂项（占比10%）染色体数少于48条，4个分裂项（占比3.64%）的染色体数多于48条，因此确定尖翅燕鱼的二倍体染色体数为2n＝48（图1，左）。

表1 尖翅燕鱼中期染色体数目计数结果Tab.1 Results of themetaphase chromosome number of Platax teira

2.2 尖翅燕鱼染色体核型

尖翅燕鱼24对染色体中相对长度最大的为4.67±0.220，最小的为1.90±0.213。如图1（右）所示，尖翅燕鱼的染色体核型为2n＝48 t，染色体臂数NF＝48。所有48条染色体均为端着丝粒型（t型），臂比为∞（“∞”表示臂比＞7.0），而且未出现存在差异的性染色体。表2为染色体的相对长度和臂比。

表2 尖翅燕鱼各染色体的相对长度及臂比（平均值±标准差）Tab.2 Relative length and arm ratio of chromosomes of Platax teira（mean±SD）

图1 尖翅燕鱼染色体中期细胞分裂相形态（左）和核型图（右）Fig.1 Metaphase chromosomes（left）and karyotype（right）of Platax teira

2.3 不同取材方法对制片效果的影响研究

实验用头肾、鳍条和鳃组织获取制片，共获取110个中期细胞相，95个来源于第1组肾组织，占比86.4%。15个来源于第2组鳃组织和鳍条组织，占比13.6%，其中12个来源于鳃组织，占比10.9%；3个来源于鳍条组织，占比2.7%。表明在本实验条件下，尖翅燕鱼染色体制备直接注射法优于组织浸泡法。

3 讨论

本研究揭示了尖翅燕鱼染色体核型是由24对端着丝粒染色体组成，是鲈形目中最常见的染色体核型［6］。迄今为止，有记载的鲈形目鱼类研究中，大约60%的物种为48条单臂（端着丝粒）染 色 体 核 型［7-29］（附 录Ⅰ），如 雀 鲷 科（Pomacentridae）、鲷科（Sparidae）和石首鱼科（Sciaenidae）等［30］。致使非众数染色体分项出现的原因有以下几种：一是秋水仙素和PHA的浓度：使用高浓度秋水仙素和PHA或处理时间过长会影响染色体大小，难以确定着丝粒的位置，导致染色体的数量增加；使用较低浓度的秋水仙素和PHA或处理时间较短可能会诱导染色体畸变，从而导致观察到的中期染色体数量减少。二是滴片过程中的高度，该因素会影响染色体扩散程度，有研究表明［3］，15 cm被认为是最佳的滴片高度。三是制片过程中压片冲击可导致染色体丢失或重叠致使计数不准确［4］。

附录Ⅰ 36种鲈形目鱼的染色体特征AppendixⅠ Chromosome characteristics of 36 species of Perciformes fishes

染色体多样性的研究对不同鱼种的分类、进化和相互关系都有着重要意义，并且能为鱼类的遗传选择提供细胞遗传学依据［31-32］。然而，在比较不同研究的种间或种内的着丝粒染色体数目时应当谨慎，因为置信区间的确定可能取决于染色体收缩程度［4］。染色体制片成功的前提是获取细胞分裂快、代谢活动旺盛的组织［33］，头肾作为硬骨鱼重要的造血和免疫器官，细胞分裂速度较快，因而为制片首选。本实验表明，通过对鳍条和鳃组织的浸泡处理也可完成制片，而就鳍条和鳃组织而言，其制片结果也存在差异，鳃组织的制片效果略优于鳍条组织，造成该结果的原因可能是尖翅燕鱼鳍条过大，细胞分裂较慢，从而影响了实验结果。蒋俊等［34］利用鳃组织成功制备了凤鲚（Coiliamystus）的染色体标本，获得了理想的分裂项细胞，可见鳃组织是尖翅燕鱼制备染色体核型的理想组织。鳃组织制片与肾组织制片相比，用鳃组织作为实验材料，可降低实验成本，且操作简单无需注射［35］，更适用于活力强或极易死亡品种的细胞遗传学研究。

核型是对染色体数量和形态的描述，每种鱼都有其独特的染色体核型。有研究［11］根据真骨鱼类的系统演化关系将染色体核型分为高位、中位、低位共3个演化类群。鱼类的演化类群进化越高，其染色体数目分布表现为越收敛，端部着丝粒染色体越多，染色体臂数越少［36］。李树深等［37-38］在研究中指出，在特定的分类阶元中，端部着丝粒染色体占据大部分时，该鱼属于原始类型，而具有较多中部或亚中部着丝粒染色体时，被称为是特化类型；而与染色体臂数多的类群相比，染色体臂数少的类群更可能为原始种［39］。本研究发现，尖翅燕鱼24对染色体均为端部着丝粒染色体（t型），其染色体数目极为收敛，并且染色体臂数为48，按上述分类依据划分，尖翅燕鱼属于高位演化类群。

赵金良［40］研究表明，2n＝48的核型数量占海洋鱼类核型的72%，而本研究中尖翅燕鱼的核型数量与大多数海洋鱼类的核型一致。本次实验运用的样本为尖翅燕鱼幼鱼，核型图片中未发现异型染色体，因此推测，决定尖翅燕鱼的性别基因在常染色体上。今后研究方向拟在尖翅燕鱼的繁殖期以性成熟的成鱼为研究材料，通过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术对染色体进行深入研究，进一步剖析性染色体决定的类型。