circ_0000285靶向miR-127-5p调控阿尔茨海默病细胞模型的损伤①

刘 洁 米亚静 张 典 史宏恩 （西安医学院基础医学部，西安 710021）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是最常见的进行性神经退行性疾病，以认知障碍、学习和记忆缺陷以及语言技能丧失为特征，是危害全球老年人健康的重大疾病［1］。近年来虽然AD 的诊断和治疗研究不断发展，但仍缺乏抑制AD 进展的有效策略。环状RNA（circRNA）是由前体RNA反向剪切形成的共价封闭转录本，其通过与特定的微小RNA（miRNA）结合发挥内源性miRNA 抑制剂作用包括AD 等神经退行性疾病的发展中发挥重要作用［2-3］。研究显示，circ_0000950 在体外AD 模型中可促进神经元凋亡和炎症反应，抑制神经突生长［4］。研究发现circ_0000285 表达增加对喉癌、膀胱癌进展具有抑制作用。在糖尿病肾病小鼠模型中，circ_0000285表达增加并促进足细胞损伤［5］。然而，circ_0000285 在AD 进展中的潜在作用及机制尚不清楚。miR-127-5p 是一类短链非编码RNA，研究显示骨关节炎软骨细胞中miR-127-5p 表达降低，上调其表达可促进软骨细胞增殖并抑制炎症反应［6］。circRNA 33186 直接结合并抑制miR-127-5p 表达参与骨关节炎进展［7］。本研究通过生物信息学分析发现miR-127-5p 是circ_0000285 的潜在靶点，于是假设miR-127-5p可能参与circ_0000285介导的AD进展。本研究以Aβ25-35诱导SK-N-SH细胞建立AD细胞模型，旨在探讨circ_0000285 靶向miR-127-5p 对Aβ25-35诱导的SK-N-SH细胞损伤的作用和分子机制［8］。

1 材料与方法

1.1 材料 神经母细胞瘤细胞SK-N-SH 购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心；Aβ25-35（超纯水将Aβ25-35 冻干粉制成1 mmol/L 储存液保存在-20 ℃冰箱备用，使用前稀释至所需浓度）购自美国Sigma公司；逆转录试剂盒、SYBR Green 试剂盒购自大连TaKaRa 生物公司；TRIzol 试剂、二喹啉甲酸（BCA）试剂盒、丙二醛（MDA）含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性检测试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒购自北京百奥莱博生物公司；miRNA 模拟物（mimics）、miRNA 抑制物（anti-miR）、小干扰RNA（si-RNA）、过表达载体（pcDNA-RNA）由上海生工公司提供；鼠抗人B 细胞淋巴瘤（Bcl-2）单克隆抗体、鼠抗人Bcl 相关x 蛋白（Bax）单克隆抗体、鼠抗人磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体、羊抗鼠IgG二抗购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和模型构建 SK-N-SH 细胞采用补充10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM 培养基在37 ℃、含5% CO2湿润的培养基中培养。将对数期SK-N-SH 细胞接种6 孔板，用含5 μmol/L Aβ25-35 的DMEM 培养基孵育细胞24 h 建立AD细胞模型。

1.2.2 实时定量PCR（RT-qPCR）检测circ_0000285 和miR-127-5p 表达量 参照TRIzol 试剂使用说明提取AD 模型细胞中的总RNA，紫外分光光度计测定OD260进行RNA 样品定量。每组取1 μg 的RNA 样品通过逆转录试剂盒进行cDNA 合成，然后利用SYBR Green试剂盒对cDNA产物进行RT-qPCR。采用2-ΔΔCt方法计算circ_0000285（内参为GAPDH）和miR-127-5p（内参为U6）表达量。U6正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH 正 向 引 物5'-CCTTCTCTTGTGTGACAAAGTGGACA-3'，反向引物5'-CATTTGATGTTAGCGGGATCTCG-3'；circ_0000285 正向引物5'-TACCTCTGCAGGCAGGAACT-3'，反向引物5'-TCACATGAATTTAGGTGGGACTT-3'；miR-127-5正向引物5'-GCCGAGCTGAAGCTCAGAGG-3'，反向引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。

1.2.3 细胞转染和实验分组 将对数期SK-N-SH细胞接种于6 孔板，细胞汇合度达50%时利用脂质体Lipofectamin 2000 将si-circ_0000285、si-NC、miR-127-5p mimics、miR-NC 分别转染至细胞，转染48 h后收获细胞。用含5 μmol/L Aβ25-35的DMEM 培养基处理转染细胞24 h，根据转染序列不同分为AD+si-circ_0000285 组、AD+si-NC 组、AD+miR-127-5p组、AD+miR-NC 组。未转染SK-N-SH 细胞采用5 μmol/L 的Aβ25-35 处理24 h 记为AD 组，未处理SK-N-SH细胞记为对照（Con）组。

1.2.4 试 剂 盒 检 测MDA 水 平、SOD 和GSH-Px 活性 收集各组SK-N-SH 细胞至离心管，离心弃上清。按照试剂盒说明书加入提取液，冰浴、超声波破碎细胞，4 ℃、10 000 r/min 离心10 min，收集上清置于冰上。按照各个试剂盒操作步骤分别测定MDA水平、SOD和GSH-Px活性。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 采用500 μl 结合缓冲液重悬各组细胞，调整细胞密度为1×105个/ml，依次加入5 μl 的Annexin V-FITC 以及5 μl 的PI，暗室孵育30 min后，1 h内采用流式细胞仪分析细胞凋亡情况（Annexin-V染色阳性细胞为凋亡细胞）。

1.2.6 Western blot 分析Bcl-2和Bax蛋白表达 以RIPA 缓冲液提取细胞中总蛋白，BCA 试剂盒测定每个样品的浓度。取20 μg 蛋白样品进行SDSPAGE 凝胶电泳，并转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。PVDF膜采用5%脱脂牛奶封闭2 h后，用一抗在4 ℃孵育膜过夜，再用适当的二抗在室温下孵育膜1 h。化学发光试剂盒进行显色反应，Image J 软件评估蛋白条带灰度值，以目的蛋白和内参GAPDH 灰度值比值表示对应蛋白表达量。

1.2.7 双荧光素酶报告实验 将含有miR-127-5p结合位点的circ_0000285 野生（WT）序列或突变（MUT）序列克隆到pGL3-荧光素酶基本载体，构建荧光素酶报告载体WT-circ_0000285、MUT-circ_0000285，该步骤由上海生工公司完成。利用Lipofectamine 2000将报告载体分别与miR-127-5p mimics、miR-NC共转染至SK-N-SH细胞，使用双重荧光素酶转运蛋白测定试剂盒分析转染24 h 后细胞相对荧光素酶活性。将pcDNA、pcDNA-circ_0000285、si-NC、si-circ_0000285 分别转染至SK-N-SH 细胞，RTqPCR检测转染48 h细胞中miR-127-5p表达量。

1.3 统计学分析 每组设置3个平行，实验独立重复3 次。使用SPSS18.0 进行统计分析，独立样本t检验用于评估两组间差异，单因素方差分析和SNK-q检验用于分析多组间差异。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circ_0000285 和miR-127-5p 在AD 细 胞 模 型中的表达 AD组细胞中circ_0000285表达量较Con组显著增加（P＜0.05），而miR-127-5p 表达量较Con组显著减少（P＜0.05，表1）。

表1 circ_0000285 和miR-127-5p 在AD 细胞模型中的表达（±s，n=9）Tab.1 Expressions of circ_0000285 and miR-127-5p in AD cells model（±s，n=9）

表1 circ_0000285 和miR-127-5p 在AD 细胞模型中的表达（±s，n=9）Tab.1 Expressions of circ_0000285 and miR-127-5p in AD cells model（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05.

Groups Con AD t P circ_0000285 1.00±0.07 2.69±0.221）21.961 0.000 miR-127-5p 1.00±0.06 0.37±0.031）28.174 0.000

2.2 干扰circ_0000285表达对AD 细胞模型氧化应激的影响 与Con 组相比，AD 组细胞中circ_0000285表达量、MDA含量显著升高（P＜0.05），SOD和GSH-Px 活性显著降低（P＜0.05）；相较于AD+si-NC 组，AD+si-circ_0000285 组 细 胞 中circ_0000285表达量、MDA 含量显著降低（P＜0.05），SOD 和GSHPx活性显著升高（P＜0.05，表2）。

表2 干扰circ_0000285表达对AD细胞模型氧化应激的影响（±s，n=9）Tab.2 Effects of interference with circ_0000285 expression on oxidative stress in AD cell model（±s，n=9）

表2 干扰circ_0000285表达对AD细胞模型氧化应激的影响（±s，n=9）Tab.2 Effects of interference with circ_0000285 expression on oxidative stress in AD cell model（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with AD+si-NC group，2）P＜0.05.

Groups Con AD AD+si-NC AD+si-circ_0000285 F P circ_0000285 1.00±0.05 2.68±0.251）2.71±0.26 1.49±0.112）184.354 0.000 MDA/（μmol·L-1）6.04±0.33 40.01±3.841）41.57±3.09 8.73±0.692）540.573 0.000 SOD/（U·mg-1）56.83±3.19 18.05±1.491）17.99±1.57 45.03±3.492）511.526 0.000 GSH-Px/（U·mg-1）67.85±5.10 26.39±2.081）25.93±2.06 58.74±3.482）365.114 0.000

2.3 干扰circ_0000285表达对AD 细胞模型凋亡的影响 与Con组相比，AD组细胞凋亡率、Bax蛋白表达量显著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；与AD+si-NC 组 相 比，AD+si-circ_0000285 组细胞凋亡率、Bax 蛋白表达量显著降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达量显著升高（P＜0.05，表3、图1）。

图1 干扰circ_0000285表达对AD细胞模型凋亡的影响Fig.1 Effects of interference with circ_0000285 expression on apoptosis of AD cell model

表3 干扰circ_0000285 表达对AD 细胞模型凋亡的影响（±s，n=9）Tab.3 Effects of interference with circ_0000285 expression on apoptosis of AD cell models（±s，n=9）

表3 干扰circ_0000285 表达对AD 细胞模型凋亡的影响（±s，n=9）Tab.3 Effects of interference with circ_0000285 expression on apoptosis of AD cell models（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with AD+si-NC group，2）P＜0.05.

Groups Con AD AD+si-NC AD+si-circ_0000285 F P Apoptosis rate/%6.08±0.46 29.05±2.681）30.19±2.32 10.74±1.052）398.912 0.000 Bcl-2 protein 0.73±0.04 0.31±0.031）0.29±0.03 0.67±0.042）388.800 0.000 Bax protein 0.14±0.02 0.61±0.031）0.62±0.05 0.25±0.022）521.429 0.000

2.4 circ_0000285 靶 向 调 控miR-127-5p 的 表 达在circular RNA Interactome工具中输入circ_0000285基因号进行靶基因预测发现circ_0000285 与miR-127-5p 序列间存在特异性结合序列，见图2。与转染miR-NC 相比，转染miR-127-5p mimics 显著降低WT-circ_0000285 的相对荧光素酶活性（P＜0.05），而对MUT-circ_0000285 的相对荧光素酶活性无显著影响，见表4。pcDNA-circ_0000285 组细胞中miR-127-5p 表达量较pcDNA 组显著降低，而si-circ_0000285 组细胞中miR-127-5p 表达量较si-NC 组显著升高（P＜0.05，表5）。

表5 circ_0000285调控miR-127-5p的表达（±s，n=9）Tab.5 circ_0000285 regulates expression of miR-127-5p（±s，n=9）

表5 circ_0000285调控miR-127-5p的表达（±s，n=9）Tab.5 circ_0000285 regulates expression of miR-127-5p（±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05；compared with si-NC group，2）P＜0.05.

Groups pcDNA pcDNA-circ_0000285 si-NC si-circ_0000285 t P miR-127-5p 1.00±0.05 0.39±0.031）1.03±0.05 2.61±0.212）647.970 0.000

图2 circ_0000285 的序列中含有与miR-127-5p 互补的核苷酸序列Fig.2 Sequence of circ_0000285 contains a nucleotide sequence complementary to miR-127-5p

表4 双荧光素酶报告实验（±s，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiment（±s，n=9）

表4 双荧光素酶报告实验（±s，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiment（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-127-5p t P WT-circ_0000285 1.01±0.08 0.48±0.041）17.177 0.000 MUT-circ_0000285 1.02±0.06 0.99±0.05 0.152 0.266

2.5 miR-127-5p 过表达对AD 细胞模型损伤的影响 与AD+miR-NC 组相比，AD+miR-127-5p 组细胞中miR-127-5p 表达量显著升高（P＜0.05），MDA 含量、凋亡率、Bax 蛋白表达量显著降低（P＜0.05），而SOD、GSH-Px 活性、Bcl-2 蛋白表达量显著升高（P＜0.05，图3、表6）。

表6 miR-127-5p过表达对AD细胞模型损伤的影响（±s，n=9）Tab.6 Effects of miR-127-5p overexpression on damage of AD cell models（±s，n=9）

表6 miR-127-5p过表达对AD细胞模型损伤的影响（±s，n=9）Tab.6 Effects of miR-127-5p overexpression on damage of AD cell models（±s，n=9）

Note：Compared with AD+miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups AD+miR-NC AD+miR-127-5p t P miR-127-5p 1.00±0.06 3.02±0.231）25.495 0.000 MDA/（μmol·L-1）41.99±3.16 13.83±1.221）24.940 0.000 SOD/（U·mg-1）15.98±1.26 39.96±3.291）20.420 0.000 GSH-Px/（U·mg-1）24.53±2.08 51.54±4.481）16.405 0.000 Apoptosis rate/%32.15±2.21 13.64±1.091）22.535 0.000 Bcl-2 protein 0.28±0.02 0.61±0.041）22.137 0.000 Bax protein 0.64±0.05 0.31±0.031）16.978 0.000

图3 miR-127-5p过表达对AD细胞模型凋亡的影响Fig.3 Effects of miR-127-5p overexpression on apoptosis of AD cell models

2.6 抑制miR-127-5p 表达逆转了干扰circ_0000285 表达对AD 细胞模型损伤的作用 与AD+si-circ_0000285+anti-miR-NC 组 相 比，AD+si-circ_0000285+anti-miR-127-5p组细胞中miR-127-5p表达量显著降低（P＜0.05），MDA 含量、凋亡率、Bax 蛋白表达量显著升高（P＜0.05），而SOD 和GSH-Px 活性、Bcl-2蛋白表达量显著降低（P＜0.05，表7、图4）。

图4 抑制miR-127-5p 表达逆转了干扰circ_0000285 表达对AD细胞模型凋亡的作用Fig.4 Inhibition of miR-127-5p reversed effect of interference with circ_0000285 expression on apoptosis of AD cell models

表7 抑制miR-127-5p表达逆转了干扰circ_0000285表达对AD细胞模型损伤的作用（±s，n=9）Tab.7 Inhibition of miR-127-5p reversed effect of interference with circ_0000285 expression on damage of AD cell model（±s，n=9）

表7 抑制miR-127-5p表达逆转了干扰circ_0000285表达对AD细胞模型损伤的作用（±s，n=9）Tab.7 Inhibition of miR-127-5p reversed effect of interference with circ_0000285 expression on damage of AD cell model（±s，n=9）

Note：Compared with AD+si-circ_0000285+anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups AD+si-circ_0000285+anti-miR-NC AD+si-circ_0000285+anti-miR-127-5p t P miR-127-5p 1.00±0.06 0.24±0.021）36.050 0.000 MDA/（μmol·L-1）8.88±0.59 33.23±2.241）31.536 0.000 SOD/（U·mg-1）47.74±3.36 28.93±2.451）13.570 0.000 GSH-Px/（U·mg-1）61.11±4.33 36.15±2.631）14.780 0.000 Apoptosis rate/%10.14±0.87 21.19±2.171）14.179 0.000 Bcl-2 protein 0.69±0.04 0.38±0.031）18.000 0.000 Bax protein 0.23±0.02 0.51±0.041）18.783 0.000

3 讨论

Aβ对神经元和神经突触均有毒性，其可破坏突触传递并导致突触变性导致神经元功能障碍［8］。Aβ25-35 是全长Aβ1-42 肽的部分片段，具有体积小、在脑内易扩散等优势，其处理的Aβ25-35已被广泛应用于AD 体外模型的建立［9］。本研究旨在通过体外实验证实circ_0000285 靶向miR-127-5p 对AD模型细胞损伤的作用和分子机制。

本研究发现Aβ25-35 处理后SK-N-SH 细胞中circ_0000285表达量显著升高，提示circ_0000285表达上调可能与AD 进展相关。研究发现氧化应激与AD发病机理各阶段、病理特征形成密切相关，AD患者与正常人相比表现出较强的氧化损伤［10］。当机体氧化抗氧化系统失衡时导致活性氧过量生成诱导过膜脂氧化反应，导致过氧化损伤标志物MDA大量形成［11］。本研究通过转染si-circ_0000285 进行功能缺失验证结果显示，干扰circ_0000285 表达可显著降低Aβ25-35 处理的SK-N-SH 细胞中MDA 水平，升高抗氧化酶SOD 和GSH-Px 活性，提示干扰circ_0000285 能够减轻Aβ25-35 诱导的SK-N-SH 细胞氧化损伤。Bcl-2 和Bax 是参与细胞凋亡调控的重要因子，Bax 表达增加可移位至线粒体改变膜通透性促进细胞凋亡发生，而Bcl-2 发挥相反作用，研究证实miR-129-5p 通过上调Bcl-2 表达、下调Bax 表达可抑制AD 模型细胞的凋亡［12］。本研究发现，干扰circ_0000285 可显著降低Aβ25-35 诱导的SK-N-SH中Bax 表达水平，升高Bcl-2 表达水平，提示干扰circ_0000285 可能通过调控线粒体途径抑制Aβ25-35 诱导的SK-N-SH 细胞凋亡。以上研究证实干扰circ_0000285 通过抗氧化、抗凋亡作用保护SK-NSH 免受Aβ25-35 诱导的细胞损伤，这与干扰circ_0000285 在糖尿病肾病中对足细胞的保护作用一致［5］。

目前对circ_0000285 的研究多集中在肿瘤方面，且多篇文献表明circ_0000285 的功能作用均与调控miRNA 表达相关。研究发现circ-0000285通过下调miR-599 表达显著增加骨肉瘤细胞、肝癌的增殖和迁移潜能［13-14］。在宫颈癌中circ_0000285 通过靶向miR-197-3p 调节癌细胞活力、集落形成、凋亡和自噬［15］。本研究中通过生物信息学预测、双荧光素酶报告实验证实在SK-N-SH 细胞中miR-127-5p表达受到circ_0000285 的靶向负性调控。既往研究表明，miR-127-5p 在肺炎链球菌感染肺泡上皮细胞中表达下调，过表达miR-127-5p 可抑制肺炎链球菌诱导的细胞损伤［16］。circ_0136474 通过抑制miR-127-5p 表达进而抑制骨关节炎细胞增殖，同时增强细胞凋亡［17］。本研究显示Aβ25-35 处理后SK-N-SH细胞中miR-127-5p 表达量显著降低，通过转染miR-127-5p mimics 恢复miR-127-5p 表达进行功能分析，结果表明，过表达miR-127-5p 通过上调Bcl-2 蛋白表达，下调Bax 蛋白表达来调控SK-N-SH 细胞凋亡，并通过降低细胞中MDA水平，升高抗氧化酶SOD和GSH-Px 活性来减轻Aβ25-35 诱导的SK-N-SH 细胞损伤。深入分析发现，抑制miR-127-5p 表达可显著减弱干扰circ_0000285 表达对Aβ25-35 诱导的SKN-SH 细胞凋亡和氧化损伤的影响，提示circ_0000285 部分通过靶向miR-127-5p 参与调控Aβ25-35诱导的SK-N-SH细胞损伤。

总之，干扰circ_0000285 表达可通过靶向miR-127-5p 减弱Aβ25-35诱导的SK-N-SH 细胞损伤。因此，circ_0000285/miR-127-5p途径可能是AD 的潜在治疗靶点。