按不同时间方案注射的乙肝免疫球蛋白与乙肝疫苗对小鼠脾脏淋巴细胞亚群的影响①

闫柳柳 王 爽 张 晓 魏 涛 韩 迪 张 磊 （青岛大学，青岛 266000）

乙型肝炎在全世界范围流行［1-2］。中国是乙肝大国，1992 年卫生部乙肝血清流行病调查数据显示中国有1.2 亿乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）携带者，给患者、家庭及社会带来沉重的负担［3］。接种乙肝疫苗是预防HBV 感染最经济有效的措施［4］。我国于1992年将乙肝疫苗纳入免疫规划，已取得显著成效［5-6］。2017 年数据显示HBV 携带者约7 000 万，较1992 年明显下降［7］；2019 年数据显示乙肝表面抗原阳性率为5%～6%，较1992 年的9.8%、2006 年的7.2%明显下降［5，8］。乙肝疫苗纳入计划免疫的20 余年来，也随之产生了新问题，即当年纳入计划免疫的人群已经进入孕龄期，近年数据显示孕龄期人群乙肝表面抗体（抗-HBs）阳性率可达56%～59%［9-10］。母体抗-HBs可通过胎盘传给胎儿，前期人群调查及动物实验结果均提示新生儿体内来自母亲的抗-HBs 会影响乙肝疫苗诱导的体液免疫应答效果［9，11-12］。进而推测，推迟接种乙肝疫苗或许会获得更好的免疫应答效果。主动免疫包括体液免疫与细胞免疫，若细胞免疫也受影响，上述问题将成为一个亟须解决的公共卫生问题。由于伦理、规范等因素限制，课题组通过小鼠实验对上述问题进行探讨。本研究从细胞水平探讨按不同时间方案注射的乙肝免疫球蛋白与乙肝疫苗对BALB/c 小鼠脾脏淋巴细胞亚群的影响，进而分析在抗-HBs 存在的前提下，推迟接种乙肝疫苗是否有助于体液免疫应答，并初步观察不同注射方案对细胞免疫应答的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6～8 周龄SPF 级BALB/c 小鼠120 只（雌雄各60 只），购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司。每笼5 只小鼠，饲养于青岛大学医学部动物中心小鼠饲养室。饲养环境清洁，温度22～25 ℃，湿度40%～60%，12 h 昼夜交替，自由饮水和摄入标准饲料。本动物实验获青岛大学附属青岛市市立医院医学伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂与仪器 乙型肝炎免疫球蛋白（hepatitis B immunoglobulin，HBIG）购自山东泰邦生物制品有限公司；汉逊酵母重组乙型肝炎疫苗购自大连汉信生物制药有限公司；胎牛血清、RPMI1640培养基购自美国Hyclone 公司；红细胞裂解液、PBS购自北京索莱宝科技有限公司；PE anti-mouse CD3、PE-Vio770 anti-mouse CD4、FITC anti-mouse CD8a 和PerCP-Vio700 anti-mouse CD19 均购自德国美天旎生物技术有限公司；贝克曼DxFLEX 流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 所有小鼠根据HBIG 与第1 针乙肝疫苗接种时间间隔分为3 组，每组按乙肝疫苗接种剂量分为2个亚组，见表1。小鼠于第3针乙肝疫苗接种后4 周提取脾脏淋巴细胞。HBIG 为腹腔注射，乙肝疫苗为后肢肌肉注射。

表1 小鼠分组及免疫方案Tab.1 Mice grouping and immunization schedule

1.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞分离及检测 分离小鼠脾脏，置于含1 ml RPMI1640 培养基液的无菌培养皿内轻轻研磨。将获得的细胞悬液转移至1.5 ml Ep 管，20 ℃、1 500 r/min 离心2 min 后弃上清。加入700 μl红细胞裂解液，裂解时间为2 min。加700 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，20 ℃、1 500 r/min离心2 min 后弃上清。加入1 ml 含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液重悬细胞，通过细胞过滤器（400 目）过滤至另一个1.5 ml Ep 管。调整细胞浓度至1.0×106个/ml。取100 μl 细胞悬液，将荧光抗体按说明书比例加入细胞悬液，避光静置10 min，然后以20 ℃、300 g 离心5 min，弃上清，以200～300 μl PBS重悬细胞。使用流式细胞仪检测淋巴细胞亚群（CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+）所占比例。1.3 统计学处理 所有数据采用SPSS22.0统计软件进行处理。淋巴细胞亚群比例以父群%表示，计量资料采用表示，组间比较采用单因素方差分析或t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 按不同时间方案注射的HBIG 及乙肝疫苗影响小鼠脾脏淋巴细胞亚群比例 在乙肝疫苗剂量为1 μg的小鼠中，CD3+及CD3+CD4+T淋巴细胞在3组中所占比例差异在雄、雌鼠中均有统计学意义，其共同点为2 周组所占比例最高，4 周组最低。CD3+CD8+T淋巴细胞在三组中所占比例差异在雄鼠中有统计学意义，其中2 周组所占比例最高，4 周组最低。三组CD4/CD8 在雄、雌鼠中差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.001），其共同点为2 周组所占比例最高，4 周组最低。CD3-CD19+B 淋巴细胞在3 组中所占比例差异在雄、雌鼠中差异均有统计学意义（P=0.003，P＜0.001），其共同点为4周组CD3-CD19+B淋巴细胞所占比例最高，2 周组最低。组间比较见表2，组内比较见图1、图2。

表2 按不同时间方案注射的HBIG与1 μg乙肝疫苗对小鼠脾脏淋巴细胞亚群比例的影响（±s，n=60）Tab.2 Effect of HBIG and 1 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in mice（±s，n=60）

表2 按不同时间方案注射的HBIG与1 μg乙肝疫苗对小鼠脾脏淋巴细胞亚群比例的影响（±s，n=60）Tab.2 Effect of HBIG and 1 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in mice（±s，n=60）

Groups Male Female Items CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+0 week/%37.63±7.34 26.74±5.25 10.49±2.50 2.59±0.35 41.71±5.08 44.93±12.08 31.81±8.80 11.70±3.37 2.74±0.38 32.29±9.45 2 week/%42.51±6.35 30.54±5.40 11.06±1.20 2.75±0.31 40.62±3.98 49.29±10.21 36.26±6.90 10.45±3.99 3.70±0.89 27.66±7.15 4 week/%31.63±5.20 21.05±4.40 8.95±1.44 2.35±0.36 47.54±3.72 34.00±3.98 23.24±3.21 9.15±1.00 2.54±0.17 44.49±3.65 F 7.346 8.980 3.645 3.455 7.501 6.998 9.697 1.721 12.056 14.759 P 0.003 0.001 0.040 0.046 0.003 0.004 0.001 0.198＜0.001＜0.001

图1 按不同时间方案注射的HBIG 与1 μg 乙肝疫苗对雄鼠脾脏淋巴细胞亚群比例的影响Fig.1 Effect of HBIG and 1 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in male mice

图2 按不同时间方案注射的HBIG 与1 μg 乙肝疫苗对雌鼠脾脏淋巴细胞亚群比例的影响Fig.2 Effect of HBIG and 1 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in female mice

在乙肝疫苗剂量为2 μg 的小鼠中，CD3+、CD3+CD4+T 淋巴细胞在3 组中所占比例差异在雄、雌鼠中差异均有统计学意义，其共同点为2 周组所占比例最高，4 周组最低。CD3+CD8+T 淋巴细胞在3 组中所占比例差异在雄、雌鼠中均有统计学意义（P=0.001 或P＜0.001），其中雄鼠中在2周组所占比例最高，4周组最低，雌鼠中在0周组所占比例最高，4周组最低。3组CD4/CD8在雌鼠中差异有统计学意义（P＜0.001），2周组最高，0周组最低。CD3-CD19+B淋巴细胞在3 组中所占比例差异在雄、雌鼠中均有统计学意义，其共同点为4 周组CD3-CD19+B 淋巴细胞所占比例最高，0 周组最低。组间比较见表3，组内比较见图3、图4。

图3 按不同时间方案注射的HBIG 与2 μg 乙肝疫苗对雄鼠脾脏淋巴细胞亚群比例的影响Fig.3 Effect of HBIG and 2 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in male mice

图4 按不同时间方案注射的HBIG 与2 μg 乙肝疫苗对雌鼠脾脏淋巴细胞亚群比例的影响Fig.4 Effect of HBIG and 2 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in female mice

表3 按不同时间方案注射的HBIG与2 μg乙肝疫苗对小鼠脾脏淋巴细胞亚群比例的影响（±s，n=60）Tab.3 Effect of HBIG and 2 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in mice（±s，n=60）

表3 按不同时间方案注射的HBIG与2 μg乙肝疫苗对小鼠脾脏淋巴细胞亚群比例的影响（±s，n=60）Tab.3 Effect of HBIG and 2 μg hepatitis B vaccine injected at different time intervals on spleen lymphocyte subsets in mice（±s，n=60）

Groups Male Female Items CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+0 week/%38.03±7.95 28.17±6.12 10.33±2.67 2.76±0.24 36.43±5.41 43.70±5.55 30.16±4.23 13.69±1.99 2.21±0.13 30.79±2.38 2 week/%45.97±9.41 31.93±7.14 11.30±2.66 2.84±0.28 38.97±10.40 48.09±10.55 35.21±7.68 9.45±2.46 3.79±0.44 34.76±13.17 4 week/%27.64±2.27 19.32±1.86 6.91±0.61 2.81±0.32 52.66±4.43 30.34±3.44 20.72±2.98 7.86±1.14 2.67±0.37 49.16±4.98 F 14.419 12.265 9.706 0.199 13.708 16.642 18.943 24.107 56.322 13.733 P＜0.001＜0.001 0.001 0.821＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 乙肝疫苗剂量影响小鼠脾脏淋巴细胞亚群比例 在0周组、2周组及4周组中，分别分析每组中乙肝疫苗剂量对淋巴细胞亚群的影响。见表4、表5。在雄鼠中，0 周组CD3-CD19+B 淋巴细胞比例在1 μg组高于2 μg 组，差异有统计学意义（P=0.037）；2 周组中各指标差异均无统计学意义；4 周组中CD3+、CD3+CD8+T 淋巴细胞比例在1 μg 组高于2 μg 组，差异有统计学意义（P=0.048，P=0.001），CD4/CD8 在1 μg组低于2 μg组，差异有统计学意义（P=0.010），CD3-CD19+B 淋巴细胞比例在1 μg 组低于2 μg 组，差异有统计学意义（P=0.014）。

表4 乙肝疫苗剂量对雄鼠脾脏淋巴细胞亚群的影响（±s，n=60）Tab.4 Effect of hepatitis B vaccine dose on proliferation of splenic lymphocyte subsets in male mice（±s，n=60）

Groups 0 week 2 week 4 week Items CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+1 μg 37.63±7.34 26.74±5.25 10.49±2.50 2.59±0.35 41.71±5.08 42.51±6.35 30.54±5.40 11.06±1.20 2.75±0.31 40.62±3.98 31.63±5.20 21.05±4.40 8.95±1.44 2.35±0.36 47.54±3.72 2 μg 38.03±7.95 28.17±6.12 10.33±2.67 2.76±0.24 36.43±5.41 45.97±9.41 31.93±7.14 11.30±2.66 2.84±0.28 38.97±10.40 27.64±2.27 19.32±1.86 6.91±0.61 2.81±0.31 52.66±4.43 t-0.117-0.562 0.137-1.264 2.252-0.949-0.483-0.253-0.661-0.447 2.126 1.094 3.928-2.902-2.740 P 0.908 0.581 0.893 0.222 0.037 0.356 0.635 0.803 0.517 0.664 0.048 0.289 0.001 0.010 0.014

表5 乙肝疫苗剂量对雌鼠脾脏淋巴细胞亚群的影响（±s，n=60）Tab.5 Effect of hepatitis B vaccine dose on proliferation of splenic lymphocyte subsets in female mice（±s，n=60）

Groups 0 week 2 week 4 week Items CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4/CD8 CD3-CD19+1 μg 44.93±12.08 31.81±8.80 11.70±3.37 2.74±0.38 32.29±9.45 49.29±10.21 36.26±6.90 10.45±3.99 3.70±0.89 27.66±7.15 34.00±3.98 23.24±3.21 9.15±1.00 2.54±0.17 44.49±3.65 2 μg 43.70±5.55 30.16±4.23 13.69±1.99 2.21±0.13 30.79±2.38 48.09±10.55 35.21±7.68 9.45±2.46 3.79±0.44 34.76±13.17 30.34±3.44 20.72±2.98 7.86±1.14 2.67±0.37 49.16±4.98 t 0.292 0.535-1.610 4.232 0.485 0.260 0.319 0.676-0.261-1.498 2.199 1.820 2.688-0.998-2.388 P 0.773 0.600 0.125 0.001 0.638 0.798 0.753 0.508 0.797 0.156 0.041 0.085 0.015 0.331 0.028

在雌鼠中，0 周组CD4/CD8 在1 μg 组高于2 μg组，差异有统计学意义（P=0.001）；2 周组中各指标差异均无统计学意义；4 周组中CD3+、CD3+CD8+T 淋巴细胞比例在1 μg组高于2 μg组，差异有统计学意义（P=0.041，P=0.015），CD3-CD19+B 淋巴细胞比例在1 μg 组低于2 μg 组（P=0.028），差异有统计学意义。

3 讨论

HBIG 由体内含有滴度较高抗-HBs 的健康献血员血浆中筛选，经生物浓缩工艺制成，其实质即为抗-HBs［13-14］。本研究通过给小鼠注射HBIG 模拟新生儿从母体获得抗-HBs，此模型经前期实验证实可行［12］。小鼠为乙肝疫苗诱导免疫反应的常用动物［15-20］。脾脏是小鼠重要的免疫器官，是成熟淋巴细胞定居的场所，也是T 淋巴细胞介导细胞免疫和B 淋巴细胞介导体液免疫应答发生的场所［21］。以上是本研究实施的理论与实践依据。3 组小鼠在注射HBIG 后，接种第1 针乙肝疫苗的时间不同，分别为与HBIG 同时注射（0 周时注射），2 周时注射及4 周时注射，以期观察推迟接种乙肝疫苗是否能避免HBIG 的中和作用，提高乙肝疫苗免疫效果。本研究主要检测与T、B 淋巴细胞相关的经典指标，即CD3+T 淋巴细胞及其亚群（CD3+CD4+辅助性T 细胞和CD3+CD8+细胞毒性T 细胞）、CD3-CD19+B 淋巴细胞。

研究结果显示，0、2、4 周组中并未显示推迟接种乙肝疫苗会增强细胞免疫效果，即提示HBIG 并未影响乙肝疫苗诱导的细胞免疫效果。但这三组中，2周组CD3+及CD3+CD4+T淋巴细胞比例在雄、雌鼠中均显著高于0周及4周组，CD3+CD8+T淋巴细胞比例在雄鼠中2 周组显著高于其他两组。2 周组注射HBIG 后2 周注射第1 针乙肝疫苗，其诱发较强的细胞免疫效果的机制尚不清楚。有研究报道，CD3+CD4+T淋巴细胞比例在乙肝疫苗无应答组中低于乙肝疫苗高应答组，而CD3+CD8+T 淋巴细胞比例在上述两组中的比例与CD3+CD4+T 淋巴细胞分布相反［22］。本研究结果显示，在4 周组，即HBIG 对乙肝疫苗阻抑较小时，CD3+CD8+T淋巴细胞比例最低，与上述结果不矛盾，但CD3+CD4+T 淋巴细胞比例在4 周组最低，与上述结果并不一致。CD4/CD8 在1 μg 组雄、雌鼠中及2 μg 组雌鼠中均显示2 周组高于其他两组，差异有统计学意义。CD4/CD8 升高提示自身免疫性疾病、病毒性感染、变态反应降低，提示艾滋病、恶性肿瘤的进展和复发。本研究各组中CD4、CD8 的比例并未显示相反的趋势，因此二者比值并未显示出HBIG 与乙肝疫苗免疫效果的关系。另有文献报道，母体抗体对新生儿接种的多种疫苗诱导的细胞免疫均无影响［23］。关于HBIG 是否阻抑乙肝疫苗诱导的细胞免疫效果还有待进一步研究。

本研究中，CD3-CD19+B 淋巴细胞在1 μg、2 μg组雄、雌鼠中均显示4 周组中所占比例最高，与0 周组、2 周组比较差异有统计学意义，提示推迟接种乙肝疫苗受HBIG阻抑作用较小，有利于B淋巴细胞增殖。B 淋巴细胞与体液免疫密切相关，该结果进一步提示HBIG 会影响乙肝疫苗的免疫应答，推迟注射乙肝疫苗会取得更好的体液免疫效果，这与前期研究结果一致［9，12］。WEERATNA 等［15］报道，小鼠体内存在高滴度母源性抗-HBs 的前提下，B 淋巴细胞对不同种类乙肝疫苗诱导的免疫应答均较差，本研究结果与上述报道一致。本研究在细胞水平的结果也提示母体抗体通过胎盘传递给胎儿会中和出生后注射的乙肝疫苗，影响乙肝疫苗的主动免疫效果。

另外，以上各组组内比较显示，4 周组中CD3-CD19+B 淋巴细胞比例分别高于0 周组及2 周组，差异有统计意义，而0 周组与2 周组相比差异无统计意义。该结果或许提示50 IU HBIG 在2 周时仍会阻抑乙肝疫苗的主动免疫效果，而到4 周时其对乙肝疫苗的阻抑作用明显减弱，这或许提示将乙肝疫苗推迟到4周时接种既会避免来自母亲抗-HBs的中和作用，又在抗-HBs 消散前尽早接种乙肝疫苗，以避免感染HBV。有文献报道，来自母体的抗-HBs 在前四周下降幅度最大，而后下降趋势减缓［15］。关于母体抗-HBs 阳性的新生儿接种乙肝疫苗，4 周是否是最佳的接种时间点有待进一步研究。AGLADIOGLU 等［24］对在土耳其实施的两种乙肝疫苗接种方案做比较，发现2-4-9 月方案较0-2-9 月方案可取得更好的免疫效果，该结果进一步证实了本研究观点的合理性。

本研究得出乙肝疫苗剂量对T淋巴细胞亚群无显著影响，但4 周组注射1 μg 乙肝疫苗的雄鼠和雌鼠CD3-CD19+B 淋巴细胞所占比例低于注射2 μg 的雄鼠和雌鼠，差异有统计学意义，该结果提示高乙肝疫苗剂量会获得更好的体液免疫效果，这与前期研究结果一致［12］。接种较大剂量的乙肝疫苗有利于提高保护率，这在儿童及成人的调查研究中已得到证实［25-26］，本研究结果与上述报道结果一致。

本研究尚存在一些局限性：本研究根据HBIG与第1 针乙肝疫苗注射的时间间隔分为3 大组，结果显示在HBIG 存在的前提下，推迟接种乙肝疫苗可获得更好的体液免疫应答效果，而与细胞免疫应答相关的指标在不同组中未显示明显差别。该结果提示HBIG 会影响乙肝疫苗的体液免疫应答效果，对细胞免疫应答无明显影响。因本研究未设仅注射乙肝疫苗组作为对照，不能肯定本研究结果提示的结论，要证实该结论，有待优化实验设计方案做进一步研究。另外，本研究模拟的是新生儿从母体获得抗-HBs 这一现象，最理想的动物模型是用疫苗接种孕鼠，从而对获得母传抗体的幼鼠进行免疫接种。由于同期纳入符合要求的孕鼠难度大、可行性差，且幼鼠接种疫苗死亡率高、实验操作性差，故本研究采用给成年小鼠注射HBIG 模拟其从母体获得抗-HBs的方法进行实验。

本实验通过给小鼠注射HBIG 模拟母鼠抗体转运至子代，为探讨母体抗-HBs 对新生儿接种乙肝疫苗的影响提供实验模型。本研究结果提示乙肝疫苗诱导的免疫应答以体液免疫为主，若母体内存在高滴度抗-HBs，其子代适当推迟接种乙肝疫苗的时间会提高乙肝疫苗诱导的体液免疫效果。鉴于为了避免母亲抗体的中和作用，新生儿麻疹疫苗的首剂接种时间为出生后8月龄［27-28］。结合本研究结果，课题组提出优化乙肝疫苗接种方案的问题，旨在希望该问题引起社会的关注，进而通过更多研究进一步证实。