化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠LPS 及TLR4/NF-κB 信号通路的影响①

霍瑞卿 田军彪 赵敏菡 李芳钊 孙 阔 韩宇帆 （河北中医学院，石家庄 050200）

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 60 只SPF 级雄性SD 大鼠，体质量（250±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK-（京）2016-0006。所有动物饲养于河北中医学院SPF 级动物房，21～25 ℃，自由饮食取水。适应性喂养7 d 后用于后续实验。动物实验经河北中医学院动物伦理委员会批准。

1.1.2 药物及试剂 化浊解毒活血通络方（黄连6 g、茯苓15 g、泽泻6 g、丹参15 g、赤芍15 g、当归9 g、石菖蒲15 g、郁金15 g、川芎9 g、地龙15 g、甘草6 g，为广东一方制药有限公司生产的中药颗粒）；鲎试剂（ECK-0882，湛江安度斯生物有限公司）；IL-1β、TNF-α ELISA 试剂盒（SXR087、SXR039，上海森雄科技实业有限公司）；NF-κB（8242S，CST）；TLR4、Occludin 抗 体（ab13867、ab216327，美 国Abcam）；ZO-1（40-2300，美国Thermo Fisher Scientific）；β-actin（bs-0061R，北京博奥森生物技术有限公司）；Eastep Super Total RNA Extraction Kit、GoTaq qPCR Master Mix（LS1040、A6002，Promega）；Primers（260064816，生工上海总部合成部）。

1.1.3 仪器 7170A 型全自动生化仪、BX53 型显微镜、721 型可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）；RM2015 型切片机、CM1950 型冰冻切片机（德国Leica 公司）；KZ-Ⅱ型匀浆仪（北京Servicebio 公司）；2720 基因扩增仪（美国AB 公司）；CFX96 实时荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad）；D3024R 型离心机（北京DragonLab公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型构建及分组 60只SPF级SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为假手术组（Sham）、模型组（MCAO）、化浊解毒活血通络方低（TCM-L）、中（TCM-M）、高（TCM-H）组剂量组，每组12 只。改良线栓法建立缺血再灌注损伤模型：腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定，颈部皮肤乙醇消毒，颈正中线开口，钝性分离右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA），穿线备用。夹闭CCA近心端和ICA，ECA近头端两条线系死结，ECA 近心端线系活结，ECA 近心端两条线间剪一倒“V”小口，插入线栓，系紧ECA 近心端线，固定线栓，将ECA 提起，解开ICA 动脉夹，缓慢推送线栓至ICA，线端进入1.8 cm 左右感有一定阻力时停止推进，解开CCA 动脉夹，此时线栓头端正好位于大脑中动脉（middle artery，MCA）起始部，即导致阻断，缺血2 h 后拔出线栓［16］。术后快速对MCAO 模型大鼠进行神经行为学评分，0 分：无神经功能缺损症状；1 分：轻度局灶性神经功能缺损，病灶对侧（左侧）前爪不能完全伸展；2 分：中度局灶性神经功能缺损，行走时向病灶对侧（左侧）转圈；3 分：重度局灶性神经功能缺损，行走时向病灶对侧（左侧）倾倒；4 分：不能自发行走并出现意识障碍。评分＞1 分即可从神经缺损评分角度认为造模成功，每组选取3 只大鼠进行TTC 染色，梗死区脑组织呈白色则为造模成功。

高职院校一线教师大多由高学历背景、高研究能力的硕博研究生组成，他们拥有较强的教学能力和科研能力，能够承担较重的教学任务，然而缺乏敏锐的市场洞察力，科研课题偏重基础理论的研究，应用型研究较少。在选择科研项目时，重点考虑学术水平的高低和项目的新颖性，忽视了研究成果产品化的可行性，导致研究成果与实际市场需求脱节。

1.2.2 干预方法 化浊解毒活血通络方低、中、高各剂量组分别灌胃给予6.25、12.5、25 g/kg 化浊解毒活血通络方2 ml，假手术与模型组灌胃给予2 ml生理盐水，1次/d，连续3 d。再灌注72 h后戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，腹主动脉采取血液，取脑、结肠组织，一部分-80 ℃保存，一部分固定于4%多聚甲醛溶液。

1.2.3 神经功能缺损评分 脑缺血再灌注72 h 后采用改良版神经功能评分进行大鼠神经行为学评分［17］。

1.2.4 脑梗死面积测定 灌胃给药3 d 后麻醉大鼠，断头取脑，生理盐水冲洗，-20 ℃速冻20 min，置于脑槽中切片，TTC 染色，Image J 软件测定脑梗死范围百分比（%）。

1.2.5 病理学形态检测 取大鼠脑、结肠组织置于4%多聚甲醛液中固定，石蜡包埋，常规切片，梯度乙醇脱水，HE 染色，显微镜下观察大鼠脑、结肠组织细胞形态变化。

1.2.6 TUNEL 检测脑组织细胞凋亡 取脑组织常规石蜡切片，二甲苯浸洗2次脱蜡，5 min/次，梯度乙醇浸洗水化，滴加蛋白酶K 消化增加细胞通透性，37 ℃孵育20 min，滴加100 μl TUNEL 反应混合液加盖玻片，37 ℃避光孵育1 h，滴加50 μl converterPOD加盖玻片，37 ℃避光孵育30 min，100 μl DAB 混合液显色，室温反应10 min，苏木素复染3 min后冲洗，盐酸-乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下统计凋亡细胞数（凋亡细胞被染色），随机挑选5个视野计数并拍照。

1.2.7 LPS 含量检测 取100 μl 血清，参照鲎试剂盒说明书检测LPS含量。

1.2.8 ELISA 检 测 脑 组 织IL-1β、TNF-α 及 血 清DAO 含量 参照ELISA 试剂盒说明书，检测大鼠脑组织匀浆上清中IL-1β、TNF-α 含量，同时测定其总蛋白浓度用以校正，血清中DAO 含量测定严格按照说明书进行。

1.2.9 Western blot 检测脑组织TLR4、NF-κB 及肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达 剪取脑组织、结肠组织各100 mg，加入RIPA 细胞裂解液1 ml 裂解，离心10 min，取上清，与上样缓冲液加热后进行10%SDSPAGE 凝胶电泳，转至PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗（1∶800 稀释）4 ℃孵育过夜，反复洗膜，加入二抗（1∶5 000 稀释）室温孵育2 h；ECL 发光，凝胶成像仪内观察蛋白条带并拍照，以β-actin为内参，Image J 软件定量分析蛋白相对表达，实验重复3 次。分别计算TLR4、NF-κB、ZO-1、Occludin蛋白相对表达。

1.2.10 RT-PCR 检 测 脑 组 织MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA 表达 取脑组织100 mg，剪碎，液氮研磨，加入1 ml TRIzol 匀浆，提取总RNA，采用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒逆转录为cDNA，以此cDNA 作为荧光定量模板，按照特定反应体系和反应条件进行扩增，Real time PCR反应采用两步法反应程序，预变性95 ℃10 min，44 个循环：95 ℃15 s，60 ℃60 s，4 ℃保存。引物采用Premier 5 软件设计（表1），以β-actin 为内参，Relative Quantification Study 法分析，2-ΔΔCt法计算。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 统计学分析 采用Prism7.0 软件进行统计学分析，计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 化浊解毒活血通络方对CIRI 大鼠神经功能缺失评分的影响 与Sham 组相比，MCAO 组大鼠神经功能缺失评分显著升高（P＜0.05）；与MCAO 组相比，TCM-H、TCM-M 组大鼠神经功能缺失评分降低（P＜0.05）；与TCM-H 组相比，TCM-L 组大鼠神经功能缺损评分升高（P＜0.05，表2）。

表2 各组大鼠神经功能缺失评分比较（±s，n=10）Tab.2 Comparison of neurological deficit score of rats in each group（±s，n=10）

表2 各组大鼠神经功能缺失评分比较（±s，n=10）Tab.2 Comparison of neurological deficit score of rats in each group（±s，n=10）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05；compared with TCM-H group，3）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L 0 10.10±1.521）7.70±1.062）8.10±0.992）9.90±1.103）Neurological deficit score

2.2 化浊解毒活血通络方对CIRI 大鼠脑梗死面积的影响 与Sham 组相比，MCAO 组大鼠脑梗死面积显著增加（P＜0.05）；与MCAO组相比，TCM-H、TCM-M组大鼠脑梗死面积显著缩小（P＜0.05，表3、图1）。

图1 各组大鼠脑组织TTC染色Fig.1 TTC staining of brain tissue of rats in each group

表3 各组大鼠脑梗死面积比较（±s，n=3）Tab.3 Comparison of cerebral infarct area of rats in each group（±s，n=3）

表3 各组大鼠脑梗死面积比较（±s，n=3）Tab.3 Comparison of cerebral infarct area of rats in each group（±s，n=3）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L Infarct volume/%0 28.32±2.321）13.92±0.792）15.29±5.632）22.40±2.50

2.3 化浊解毒活血通络方对CIRI 大鼠脑组织病理形态学变化的影响 Sham 组大鼠脑组织未见异常改变，细胞排列整齐，染色均匀，细胞膜完整，细胞核清晰可见，无变形坏死细胞；MCAO 组大鼠脑组织缺血区域可见大量细胞变性、坏死，细胞排列紊乱，细胞间隙增大，胞浆染色变浅，细胞核固缩、深染，有炎症细胞浸润；与MCAO 组相比，化浊解毒活血通络方各组脑组织病理状态有所改善，TCM-H 组改善最为显著（图2）。

图2 各组大鼠脑组织病理学改变（HE染色）Fig.2 Pathological changes in brain tissue of rats in each group（HE staining）

2.4 化浊解毒活血通络方对CIRI 大鼠脑组织细胞凋亡的影响 与Sham 组相比，MCAO 组大鼠脑细胞凋亡率明显上升（P＜0.05）；与MCAO组相比，TCM-H和TCM-M 组大鼠脑细胞凋亡率下降（P＜0.05）；与TCM-L 组相比，TCM-H 组大鼠脑细胞凋亡率明显降低（P＜0.05，表4、图3）。

图3 TUNEL染色法标记凋亡阳性细胞Fig.3 Apoptotic positive cells labeled by TUNEL staining

表4 各组大鼠脑细胞凋亡率（±s，n=3）Tab.4 Apoptosis rate of cells in brain of rats in each group（±s，n=3）

表4 各组大鼠脑细胞凋亡率（±s，n=3）Tab.4 Apoptosis rate of cells in brain of rats in each group（±s，n=3）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05；compared with TCM-H group，3）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L Apoptosis rate/%9.80±0.87 44.05±2.321）24.12±1.802）28.26±1.642）37.72±0.813）

2.5 化浊解毒活血通络方对CIRI 大鼠血清LPS、DAO表达的影响 与Sham组相比，MCAO组大鼠血清LPS、DAO 含量上升（P＜0.05）；与MCAO 组相比，TCM-H 组大鼠血清LPS、DAO 含量下降（P＜0.05）；与TCM-L 组相比，TCM-H 组大鼠血清LPS、DAO 含量下降（P＜0.05，表5）。

表5 各组大鼠血清LPS、DAO含量（±s，n=3）Tab.5 Serum LPS and DAO contents of rats in each group（±s，n=3）

表5 各组大鼠血清LPS、DAO含量（±s，n=3）Tab.5 Serum LPS and DAO contents of rats in each group（±s，n=3）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05；compared with TCM-H group，3）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L LPS/（EU·ml-1）0.06±0.21 0.10±0.131）0.08±0.152）0.08±0.14 0.10±0.103）DAO/（U·L-1）3.96±0.82 6.01±0.971）4.61±0.872）4.66±0.352）5.62±0.433）

2.6 化浊解毒活血通络方对CIRI 大鼠结肠病理形态学变化的影响 Sham 组大鼠结肠黏膜未见明显损伤。与Sham 组相比，MCAO 组大鼠结肠黏膜少许破坏，黏膜水肿，绒毛形态不规则，局部出现黏膜破损，化浊解毒活血通络方治疗后上述情况好转（图4）。

图4 各组大鼠结肠组织HE染色Fig.4 HE staining for colon tissues of rats in each group

2.7 化浊解毒活血通络方对CIRI 大鼠结肠组织ZO-1、Occludin 蛋白表达的影响 与Sham 组相比，MCAO 组 大 鼠Occludin、ZO-1 蛋 白 表 达 降 低（P＜0.05）；与MCAO 组相比，TCM-H、TCM-M 组大鼠Occludin、ZO-1蛋白表达有所增加，TCM-H组趋于正常（P＜0.05）；与TCM-H 组相比，TCM-L 组ZO-1 蛋白表达降低（P＜0.05，图5）。

图5 各组大鼠结肠Occludin、ZO-1蛋白表达水平比较Fig.5 Comparison of colon Occludin and ZO-1 protein expression levels of rats in each group

2.8 化浊解毒活血通络方对CIRI大鼠脑组织IL-1β、TNF-α 表达的影响 与Sham 组相比，MCAO 组大鼠IL-1β、TNF-α 表达增加（P＜0.05）；与MCAO 组相比，TCM-H、TCM-M组IL-1β、TNF-α表达减少（P＜0.05）；与TCM-H 组相比，TCM-L 组大鼠IL-1β、TNF-α 表 达增加（P＜0.05，表6）。

表6 各组大鼠脑组织IL-1β、TNF-α表达（±s，n=3，pg/mg）Tab.6 IL-1β and TNF-α expressions of brain tissues of rats in each group（±s，n=3，pg/mg）

表6 各组大鼠脑组织IL-1β、TNF-α表达（±s，n=3，pg/mg）Tab.6 IL-1β and TNF-α expressions of brain tissues of rats in each group（±s，n=3，pg/mg）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05；compared with TCM-H group，3）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L IL-1β 35.65±3.97 84.22±3.901）38.46±1.592）47.91±1.372）75.33±3.373）TNF-α 12.62±1.10 39.96±1.011）19.56±1.842）27.21±0.862）36.50±1.663）

2.9 化浊解毒活血通络方对CIRI 大鼠脑组织TLR4、NF-κB 蛋白表达的影响 与Sham 组相比，MCAO 组 大 鼠TLR4、NF-κB 蛋 白 表 达 增 加（P＜0.05）；与MCAO 组相比，TCM-H、TCM-M 组大鼠TLR4、NF-κB 蛋白表达减少（P＜0.05）；与TCM-H 组相比，TCM-L组大鼠TLR4、NF-κB蛋白表达增加（P＜0.05，图6）。

图6 各组大鼠缺血侧脑组织TLR4、NF-κB蛋白表达Fig.6 TLR4 and NF-κB protein expressions in ischemic lateral brain tissue of rats in each group

2.10 化浊解毒活血通络方对CIRI 大鼠脑组织MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA 表达的影响 与Sham组相比，MCAO 组大鼠MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA表达增加（P＜0.05）；与MCAO 组相比，TCM-H 组大鼠MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA 表达减少（P＜0.05）；与TCM-H 组 相比，TCM-L 组大鼠MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA表达增加（P＜0.05，图7）。

图7 各组大鼠缺血侧脑组织中MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA表达比较Fig.7 Comparison of MyD88，IRAK，TRAF6 mRNA expressions of cerebral tissues on ischemic side of rats in each group

3 讨论

缺血性卒中是指局部脑组织区域血液供应障碍导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而导致神经功能缺失的表现，高发于50～60岁人群，男性稍多于女性，具有高发病率、高致残率、高病死率等特点，常合并动脉硬化、高血压、高脂血症或糖尿病等危险因素或全身性非特异性症状［18］。神经系统的症状与闭塞血管供血区域脑组织及邻近受累脑组织功能有关［19］。静脉溶栓和介入取栓技术迅猛发展，为缺血性卒中提供了新的有效治疗手段［20-21］。但静脉溶栓和介入取栓均面临CIRI 问题。CIRI 指在短时间内血液灌注恢复后，神经细胞凋亡进一步加剧病理过程，导致脑组织进一步损伤。因此，治疗CIRI 是缺血性卒中治疗成功与否的关键。目前，西医在CIRI治疗方面尚无有效手段，如何治疗CIRI成为缺血性卒中治疗的瓶颈。CIRI 包括细胞自噬、细胞凋亡、线粒体功能障碍、氧化应激和炎症损伤等发病机制，其中炎症损伤是CIRI发生发展的重要环节，如何有效控制炎症损伤对改善CIRI 至关重要［22-23］。因此，本文从炎症相关通路探讨化浊解毒活血通络方对CIRI的保护作用。

缺血性卒中属于中医中风范畴，痰浊、湿热、瘀毒是其主要致病因素，“浊凝闭阻清窍，瘀毒损伤脑络”是其核心病机。脑卒中后，产生大量自由基、促炎因子不断聚集导致大脑持续缺血缺氧，导致血脑屏障破坏，微循环障碍。同时，卒中后会导致胃肠功能应激状态，肠道菌群紊乱，肠道菌群代谢产物内毒素增多，引起肠道屏障破坏，内毒素经血液循环进一步促进内环境失衡，因机体无法清除这些致病因素形成“瘀毒”使脑损伤进一步加重。化浊解毒活血通络方是田军彪教授基于以上理论及总结多年临床经验探索出的治疗缺血性卒中的中药复方，临床疗效确切。化浊解毒活血通络方中黄连清热燥湿、泻火解毒，茯苓、泽泻健脾利水渗湿，赤芍、丹参、当归、川芎活血行气化瘀，川芎味辛上行头目，有引药上行之效，石菖蒲、郁金降气化痰祛湿，地龙清热息风，甘草调和诸药。诸药合用健脾祛湿化痰、清热活血通络，既能调节肠腑功能又能减轻脑络损伤。现代药理研究表明，茯苓三萜、丹参酮和小檗碱具有调节免疫功能、减轻炎症损伤、保护肠道黏膜、维持肠道菌群稳态作用［24-26］。研究发现芍药苷和地龙水提取液可抑制促炎因子TNF-α、IL-1β表达从而减轻CIRI［27-28］。

细菌LPS 是一种细菌内毒素，是革兰氏阴性菌细胞壁中发现的炎症标志物。研究表明，细菌LPS与缺血性卒中有关。LIN 等［29］研究表明，缺血性脑卒中患者存在4 种细菌代谢途径，其中LPS 合成在缺血性脑卒中患者中明显富集，与健康对照组相比，卒中病例中观察到LPS合成富集，枸杞多糖可提高脑卒中败血症发生率。卒中后肠道菌群紊乱，菌群代谢产物LPS 增多，选择性增加大鼠结肠和回肠血管通透性，导致肠道屏障破坏后随血液循环进入大脑。LPS 可能通过两种途径进入大脑，一是通过血脑屏障薄弱区域进而在脑内弥散；二是通过与血清蛋白结合被血脑屏障中有特殊转运功能的内皮细胞所摄取［30］。

肠道屏障在防止肠腔内有害物质如细菌和内毒素进入血液循环到达其他组织、器官中具有重要作用。肠道屏障以机械屏障最为重要，其结构为完整的肠黏膜上皮细胞及上皮细胞间紧密连接。ZO-1和Occludin 是肠道黏膜屏障完整性的标志蛋白，DAO 能够反映肠道机械屏障完整性和受损程度。缺血性卒中发生后，由于肠道应激状态及肠道菌群紊乱导致肠道黏膜屏障破坏，通透性增加。张枫［31］通过透射电镜观察发现脑缺血再灌注7 d 后，肠道上皮屏障紧密连接超微结构改变，紧密连接条带变暗，结构疏松，微绒毛紊乱。张芯［32］研究发现，CIRI小鼠结肠黏膜通透性增加，血清DAO浓度升高。

课题组前期研究发现，CIRI 大鼠血脑屏障通透性增加，经化浊解毒活血通络方治疗后缺血侧梗死脑组织密连接蛋白ZO-1、Occludin表达增加，血脑屏障通透性降低［33］。本研究发现，与Sham 组相比，MCAO 组大鼠血清LPS 增加，肠黏膜水肿，炎症细胞浸润，黏膜破损，结肠组织ZO-1、Occludin表达降低，肠道屏障破坏，经化浊解毒活血通络方治疗后LPS水平降低，肠道黏膜屏障得以恢复，与上述研究结论一致，因此，推测化浊解毒活血通络方减轻CIRI与减少LPS表达、修复黏膜屏障有关。

TLR4/NF-κB 信号通路与缺血性卒中密切关系［34］。研究发现，LPS 能够与天然免疫识别受体TLR4 结合，进而介导跨膜信号转录［35］。TLR4 被LPS 激活后与MyD88 的TIR 结构域结合激活MyD88，形成有活性的TLR4/MyD88 复合物，通过其氨基端结构域招募IL-1 受体相关激酶（IL-1 receptor-associated kinase，IRAK）家族成员，使其磷酸化后与肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）结合，促使NF-κB 和NF-κB 抑制因子（inhibitor of nuclear factorκB，IκB）解聚，核定位序列暴露，从而被转运至细胞核内促进NF-κB 依赖的基因转录，进一步促进大量炎症因子转录并释放，包括TNF-α、IL-1β，导致脑组织损伤［36-37］。与此同时，TNF-α 也可刺激单核-巨噬细胞生成一系列炎症因子，如IL-1、IL-6、IL-8 等，引起瀑布反应，进一步加重缺血区域脑组织损伤，与本研究结论一致［38］。本研究发现，与Sham 组相比，TLR4、MyD88、IRAK、TRAF6、NF-κB及炎症因子IL-1β、TNF-α表达明显上调，与MCAO 组相比，化浊解毒活血通络方治疗后上述指标均不同程度下调，表明化浊解毒活血通络方可调控LPS-TLR4/NF-κB 信号通路改善CIRI。

综上所述，本研究证实化浊解毒活血通络方可保护肠道黏膜屏障，明显降低CIRI 大鼠血清LPS 水平，抑制TLR4/NF-κB 通路过度激活，降低促炎因子IL-1β、TNF-α表达，对CIRI起保护作用，为临床用药提供了理论支持。