TXNIP/NLRP3 信号通路在PCOS-IR 大鼠卵巢慢性炎症中的作用机制研究①

孙文萍 赵得雄 王榀华 王生兰 李 洁 康 燕 （青海红十字医院妇产科，青海 810000）

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）属育龄期女性内分泌代谢性疾病，以雄激素过多和持续无排卵为主要特征，主要并发症包括一系列代谢异常相关疾病，其中包括：2 型糖尿病、胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）、代谢综合征、慢性炎症等，已成为研究热点［1］。PCOS 患者IR 占50%～60%，增加了患者患高血压、脂质代谢紊乱等风险［2］。且PCOS患者促炎症因子水平升高，是一种低度慢性炎症疾病［3］。硫氧还蛋白相互作用蛋白/NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（thioredoxininteracting protein/NOD-like receptor pyrin domaincontaining protein 3，TXNIP/NLRP3）信号通路参与抗氧化应激和IR，是炎症反应和氧化应激重要信号通路之一，推测TXNIP/NLRP3 信号通路影响PCOS-IR大鼠卵巢慢性炎症［4］。基于此，建立PCOS-IR 大鼠模型，抑制TXNIP 观察卵巢慢性炎症情况，为临床治疗提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雌性SD 大鼠SPF 级均购自北京维通利华实验动物有限公司，生产许可证号：SYXK（京）-2018-0102，使用许可证号：SYXK（京）-2019-0075，体 质 量（220±10）g。所 有 大 鼠 均 在 温 度（24.5±0.5）℃、湿度（50±5）%、光照/黑暗12 h/12 h环境中常规饲养，本研究符合《关于善待实验动物的指导意见》，符合3R原则，并经青海红十字医院动物实验伦理委员会审核并批准。

1.1.2 主要试剂与仪器 脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）（北京中科恒壹科技有限公司，CAS：53-43-0）；白藜芦醇（resveratrol，RES）（美国Sigma 公司，货号：34092-100 mg）；siRNA NC、TXNIP siRNA（广州锐博生物有限公司）；大鼠空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）ELISA 试剂盒（美国RD 公司，货号：L-741）；IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 试剂盒、一抗兔抗TXNIP、NLRP3、pro-半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase1，caspase-1）、GAPDH（英国Abcam 公司，货号分别为：ab203360、ab197742、ab208348、ab188865、ab263899、ab179515、ab8245）；caspase-1（美国Biovision 公司，货号：7524-100）；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）试剂盒（美国Acmec 公司，货号：H69840）；实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）仪（赛默飞世尔公司，型号：PikoREAL）；血糖仪（上海玉研科学仪器有限公司，型号：Cholestech LDX）；蛋白凝胶成像仪（上海Tanton 公司，型号：4800）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分组 建立PCOS-IR模型大鼠，大鼠颈背部皮下注射溶于注射芝麻油0.2 ml 的DHEA 溶液（6 mg/100 g），1 次/d，连续20 d 后巴氏染色方法观察大鼠阴道脱落细胞变化，若阴道上皮细胞持续10 d 为角化状态的大鼠为诱导成功的PCOS模型大鼠；将成功PCOS 模型大鼠当晚8 时禁食，次晨8 时眼眶静脉取血做空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）和FINS 检测，并计算胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment insulin resistance，HOMA-IR），计算方法：HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。 实 验 中 将HOMA-IR＞2.8 的PCOS 大鼠，作为成功的PCOS-IR 模型，进入后续实验。共建模成功大鼠32 只，随机分为模型组、siRNA NC 组、TXNIP siRNA 组、RES 干预组，每组8 只，溶剂对照组大鼠颈背部皮下注射0.2 ml 芝麻油处理相同天数。

siRNA NC、TXNIP siRNA、RES 均溶于生理盐水备用。siRNA NC 组、TXNIP siRNA 组分别颈背部皮下注射5 nmol siRNA NC、TXNIP siRNA，5 d/次；RES干预组颈背部皮下注射50 mg/kg RES［5］，溶剂对照组和模型组颈背部皮下注射等体积生理盐水，1次/d，连续10 d。

1.2.2 血清中卵巢功能相关指标以及血糖（FBG）、胰岛素（FINS）相关指标检测 实验结束后抽静脉血，放射免疫试剂盒检测血清中睾酮（testosterone，T）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2）、胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）水平，血糖仪检测血清中FBG 水平，ELISA 检测血清中FINS 水平，并计算HOMA-IR、胰岛素敏感指 数（insulin sensitivity index，ISI），ISI=1/FINS×FBG［6］。

1.2.3 HE 染色观察卵巢卵泡发育情况 立即处死大鼠，卵巢分2 份，其中一份卵巢置于4%多聚甲醛中固定，一份置于-80 ℃冰箱保存待检。4%多聚甲醛中固定的卵巢组织，经过乙醇一系列脱水后石蜡包埋，切成6 μm 切片。经苏木精染色、伊红复染后显微镜下观察卵巢组织形态。

1.2.4 ELISA 检测血清 中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平 取5 ml 静脉血，室温静置2 h，1 000 r/min 离心10 min，取血清，采用大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒检测血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.5 qRT-PCR 检测卵巢组织中TXNIP、NLRP3 mRNA 水平 -80 ℃取50 mg卵巢组织，RNA 提取试剂盒提取卵巢组织中总RNA，cDNA 第一条链合成试剂盒合成cDNA，qRT-PCR 仪检测组织中TXNIP、NLRP3 mRNA 水平。引物序列如下：TXNIP F 5'-AAGCGTTGAGTAGTACAGATGAG-3'，R 5'-ATGGCGTGGCAAGAGTA-3'；NLRP3 F 5'-AGCCTCAGGGCACCAA-3'，R 5'-GGGATGAAGAACATAGTAAACA-3'；β-actin F 5'-GGAAATCGTGCGTGACATTAAAG-3'，R 5'-CGGCAGTGGCCATCTCTT-3'。反应 体 系：10×Mix 10 μl、cDNA（50 ng/μl）1 μl、F/R（0.5/0.5）μl、ddH2O 8 μl。反应条件：94 ℃60 s；95 ℃30 s；（TXNIP 56.8 ℃、NLRP3 61.3 ℃）60 s，40 个循环。2-ΔΔCt法计算TXNIP、NLRP3 mRNA 相对表达水平。

1.2.6 Western blot 检测卵巢组织TXNIP、NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平 -80 ℃取30 mg卵巢组织，添加蛋白裂解液冰上裂解20 min，13 400 r/min、4 ℃离心20 min，收集上清即为总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白总浓度。每孔上样30 ng，PAGE 胶分离蛋白质，PVDF 转膜；5%脱脂奶粉室温封闭后，对应加入一抗TXNIP、NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1、GAPDH，4 ℃孵育过夜；对应加入二抗，室温孵育1 h。DAB 显色试剂显色，蛋白凝胶成像仪拍照和定量分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS25.00 进行统计学分析。计量数据以表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TXNIP 对大鼠血清中卵巢功能相关指标及FBG、FINS 的影响 与溶剂对照组相比，模型组、siRNA NC 组T、LH、E2、IGF-1、FBG、FINS、HOMA-IR水平升高，FSH 水平降低（P＜0.05）；与模型组、siRNA NC 组相比，TXNIP siRNA 组、RES 干预组T、LH、E2、IGF-1、FBG、FINS、HOMA-IR 水平降低，FSH水平升高（P＜0.05，见表1。

表1 5组血清中卵巢功能相关指标以及血糖、胰岛素相关指标水平比较（xˉ±s，n=8）Tab.1 Comparison of ovarian function-related indexes and blood glucose and insulin-related indexes in serum of 5 groups（xˉ±s，n=8）

2.2 TXNIP 对大鼠卵巢发育情况的影响 溶剂对照组存在不同发育阶段的健康卵泡和黄体；模型组和siRNA NC 组卵泡腔变大、出现囊肿现象，颗粒细胞层减少；TXNIP siRNA 组和RES干预组出现黄体，卵泡腔变小，颗粒层增厚。见图1。

图1 5组大鼠卵巢形态情况（×100）Fig.1 Morphology of ovary in 5 groups（×100）

2.3 TXNIP 对大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平的影响 与溶剂对照组相比，模型组、siRNA NC 组血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；与模型组、siRNA NC 组相比，TXNIP siRNA 组、RES 干预组血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.05，表2）。

表2 5 组血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平比较（±s，ng/ml，n=8）Tab.2 Comparison of serum levels of IL-6，IL-1β and TNF-α in 5 groups（±s，ng/ml，n=8）

Note：Compared with solvent control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with siRNA NC group，3）P＜0.05.

Groups Solvent control Model siRNA NC TXNIP siRNA RES intervention F P IL-6 1.96±0.35 3.06±0.381）3.02±0.421）2.39±0.352）3）2.31±0.312）3）13.783 0.000 IL-1β 0.22±0.06 0.43±0.051）0.44±0.061）0.31±0.042）3）0.34±0.052）3）23.971 0.000 TNF-α 254.36±34.48 516.42±61.521）532.14±56.821）315.15±34.582）3）289.15±36.142）3）65.388 0.000

2.4 TXNIP 对大鼠TXNIP、NLRP3 mRNA 水平的影响 与溶剂对照组相比，模型组、siRNA NC 组卵巢组织中TXNIP、NLRP3 mRNA 水平升高（P＜0.05）；与模型组、siRNA NC 组相比，TXNIP siRNA 组、RES干预组卵巢组织中TXNIP、NLRP3 mRNA 水平降低（P＜0.05，表3）。

表3 5 组卵巢组织中TXNIP、NLRP3 mRNA 水平比较（±s，n=8）Tab.3 Comparison of TXNIP and NLRP3 mRNA levels in ovarian tissues of 5 groups（±s，n=8）

表3 5 组卵巢组织中TXNIP、NLRP3 mRNA 水平比较（±s，n=8）Tab.3 Comparison of TXNIP and NLRP3 mRNA levels in ovarian tissues of 5 groups（±s，n=8）

Note：Compared with solvent control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with siRNA NC group，3）P＜0.05.

Groups Solvent control Model siRNA NC TXNIP siRNA RES intervention F P TXNIP 1.01±0.16 2.75±0.511）2.79±0.381）1.42±0.252）3）1.96±0.312）3）42.530 0.000 NLRP3 0.99±0.09 3.48±0.391）3.57±0.411）2.45±0.242）3）1.86±0.342）3）95.573 0.000

2.5 TXNIP 对大鼠TXNIP、NLRP3、caspase-1、procaspase-1 蛋白水平的影响 与溶剂对照组相比，模型组、siRNA NC 组卵巢组织中TXNIP、NLRP3、procaspase-1/caspase-1蛋白水平升高（P＜0.05）；与模型组、siRNA NC 组相比，TXNIP siRNA 组、RES 干预组卵巢组织中TXNIP、NLRP3、pro-caspase-1/caspase-1蛋白水平降低（P＜0.05，图2、表4）。

图2 5 组大鼠卵巢组织中TXNIP、NLRP3、caspase-1、procaspase-1蛋白表达情况Fig.2 TXNIP，NLRP3，caspase-1，pro-caspase-1 protein expressions in ovarian tissues of rats in 5 groups

表4 5 组卵巢组织中TXNIP、NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1蛋白水平比较（±s，n=8）Tab.4 Comparison of TXNIP，NLRP3，caspase-1，procaspase-1 protein levels in ovarian tissues of 5 groups（±s，n=8）

表4 5 组卵巢组织中TXNIP、NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1蛋白水平比较（±s，n=8）Tab.4 Comparison of TXNIP，NLRP3，caspase-1，procaspase-1 protein levels in ovarian tissues of 5 groups（±s，n=8）

Note：Compared with solvent control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with siRNA NC group，3）P＜0.05.

Groups Solvent control Model siRNA NC TXNIP siRNA RES intervention F P TXNIP 0.23±0.03 0.76±0.081）0.78±0.081）0.46±0.052）3）0.39±0.042）3）129.056 0.000 NLRP3 0.09±0.01 0.68±0.071）0.72±0.071）0.38±0.042）3）0.16±0.022）3）281.277 0.000 caspase-1 0.69±0.08 0.72±0.10 0.70±0.08 0.65±0.08 0.73±0.09 1.040 0.400 pro-caspase-1/caspase-1 0.32±0.06 0.83±0.081）0.79±0.061）0.46±0.052）3）0.25±0.032）3）167.647 0.000

3 讨论

IR 是指骨骼、脂肪、肝等对胰岛素的敏感性下降，表现为对葡萄糖的摄取和利用障碍，机体代偿性产生更多胰岛素用于维持血糖水平，但随着β 细胞功能减弱，不能产生更多的胰岛素，增强胰岛素敏感性时，会出现糖耐量降低现象［7］。在PCOS 中，IR 时体内出现过多的葡萄糖、胰岛素和游离脂肪酸等在体内过多积累，胰岛素与其特异性受体结合后，造成受体结构和功能发生改变，导致胰岛素功能逐渐丧失，出现高糖状态［8］。研究发现，炎症因子是IR 的始动因素，炎症因子可作用于胰岛素信号通路的特定位点，从而影响信号传导［9］；在长期的慢性炎症反应过程中，各种炎症因子一方面可引起β 细胞功能衰退及IR，另一方面不同炎症因子通过协同作用干扰机体正常的葡萄糖代谢平衡进而影响血糖水平［10］。本研究发现，与溶剂对照组相比，模型组T、LH、E2、IGF-1、FBG、FINS、HOMA-IR水平升高，FSH 水平降低，提示PCOS-IR 造成卵巢功能障碍、处于高糖状态且发生IR。

RES 属于一种天然的抗炎剂，在葡萄、花生、虎杖、桑葚等植物中存在，属活性氧自由基强力清除剂，可抑制TXNIP 活性和表达，与si-TXNIP 有类似影响TXNIP 功能［11］。在脂多糖诱导的肾小管上皮细胞中，RES 能够明显抑制TXNIP/NLRP3 信号通路从而抑制炎症相关蛋白的表达从而影响炎症损伤［12］。本 研 究 以RES 和TXNIP siRNA 分 别 处 理PCOS-IR 模型，相互验证TXNIP 功能，添加RES 或TXNIP siRNA 后卵巢功能相关激素水平得以缓解、血糖水平降低、IR指标缓解。

TXNIP 是硫氧还蛋白的内源性抑制蛋白，可直接结合减少硫氧还蛋白起催化作用的活性中心并且抑制其表达和活性［13］；可通过相互结合引起细胞内活性氧化物的堆积进而诱导胰岛β细胞的损伤及凋亡［14］。NLRP3 炎症小体可触发炎症反应过程，在宿主对抗病原体、自身免疫性疾病、代谢性疾病等过程中研究广泛［15］。炎症反应是导致IR 的主要分子机制，NLRP3 通过ASC 募集caspase-1 前体，形成复合物，活化的caspase-1 促进多种炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α 等的分泌，从而引起胰岛素信号通路受阻，如PI3K 等信号通路的表达进而诱发IR［16］。IL-1β 作为促细胞炎症因子，可调节Th17 细胞因子的早期极化及与其他因子协同作用调节Th17 细胞因子的产生，可介导胰岛β 细胞凋亡或激活NF-κB 过程，进而促进炎症因子释放诱导IR 过程［17］。IL-6主要由脂肪细胞表达，而PCOS慢性炎症的机制之一是脂肪细胞的肥大，脂肪细胞肥大会促进基质血管压迫组织低灌注而缺氧，缺氧调控炎症反应关键基因激活，进而释放更多的炎症介质，参与PCOS-IR 过程［18］。TNF-α 主要由分泌细胞和巨噬细胞分泌，参与IR 和刺激脂肪分解过程［19］。TXNIP通过氧化应激等过程从硫氧还蛋白中解离出来，可直接结合并激活NLRP3，进而诱导IL-1β 的产生［20］。本研究发现，与溶剂对照组相比，模型组卵巢组织中TXNIP、NLRP3 mRNA和蛋白水平、血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高，提示PCOS-IR 卵巢组织中处于慢性炎症状态，可抑制TXNIP 与硫氧还蛋白的结合，从而游离出TXNIP，TXNIP 直接结合并激活NLRP3，通过促进内分泌或旁分泌等多种分泌途径促进IL-1β、IL-6、TNF-α 的分泌，IL-6、TNF-α 直接参与IR过程，IL-1β介导胰岛β细胞凋亡或激活NF-κB过程促进IL-6、TNF-α 释放诱导IR 过程。而抑制TXNIP 表达后可缓解上述过程，从而减轻卵巢功能相关激素、血糖、IR 相关激素表达，从而达到缓解疾病的目的，且RES与TXNIP siRNA有类似功效。

综上所述，抑制TXNIP/NLRP3 信号通路可缓解PCOS-IR大鼠卵巢慢性炎症，从而缓解疾病。