β-榄香烯对CLP诱导的脓毒症大鼠肝损伤的保护作用①

康柳枝 张雅兰 陈彩云 李剑冰 陈文发 （福建医科大学附属第二医院药学部，泉州 362000）

脓毒症是指由感染引起的全身性炎症综合征，严重的脓毒症可导致器官功能衰竭［1］。研究表明，全球脓毒症病死率高达30%～70%，且呈逐年递增趋势［2-3］。目前已知脓毒症是由炎症反应、免疫功能紊乱、组织损伤等诱发，但其具体发病机制有待进一步阐明［4］。肝脏在机体代谢和免疫调节等过程中发挥重要作用，脓毒症的发生可导致肝脏功能障碍并促进脓毒症进展，同时，肝脏通过抑制炎症反应、参与免疫调节等途径在脓毒症的发生进展中起调节作用［5-7］。因此，调节和改善肝功能是治疗脓毒症的有效手段。β-榄香烯是榄香烯的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎症、免疫调节等药理作用。有研究报道，β-榄香烯在肝损伤、肝炎及肝硬化等肝胆疾病中发挥保护作用［8］。PAN 等［9］指出，β-榄香烯通过降低促炎因子表达和调节免疫功能保护脓毒症小鼠脑损伤，同时，β-榄香烯还可抑制NF-κB活化。本实验通过建立盲肠结扎和穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）诱导的脓毒症大鼠模型，探究β-榄香烯在脓毒症大鼠肝损伤中的保护作用，并初步探索其作用机制，为β-榄香烯在脓毒症治疗及肝功能保护中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与仪器 β-榄香烯（纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司（CAS 号：515-13-9）；ELISA 试剂盒购自美国Sigma 公司（货号：MAK055-1KT、MAK052-1KT、MAK045-1KT、RAB0247-1KT）；诱导型一氧化氮合酶（iNOS）含量测定试剂盒（ab203359）、兔单克隆抗体caspase3（ab214430）、兔单克隆抗体caspase9（ab202068）、兔单克隆抗体NF-κB P65（ab239882）以及对应的HRP 标记的二抗均购自美国Abcam 公司。病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，RM2016）；光学显微镜（日本尼康，Nikon Eclipse E100）；台式高速离心机（DragonLab，D3024R）；酶标仪（Rayto，RT-6100）；成像系统（日本尼康，Nikon DS-U3）；全自动生化分析仪（迈瑞BS2000M）。

1.1.2 实验动物 50 只清洁级Wistar 雄性大鼠（8～10 周龄，体质量200～250 g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，使用许可证号：SYXK（京）2017-0033，实验动物严格遵守3R原则，并通过福建医科大学附属第二医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、建模及给药 每只大鼠给予24 h昼夜灯光照射控制及严格、规范的卡片登记管理，24 ℃条件下封闭群养。将50 只Wistar 大鼠以随机数字表法分为健康对照组、模型组、模型+β-榄香烯25 mg/kg 组、模型+β-榄香烯50 mg/kg 组、模型+β-榄香烯100 mg/kg 组，10 只/组。模型组和模型加药组大鼠参照文献［10-11］采用CLP 诱导建立脓毒症大鼠模型，10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔麻醉，腹部消毒后正中开腹，丝线结扎盲肠根部，以无菌丝线结扎盲肠远端1～1.5 cm处，18号无菌针头在已经结扎的盲肠远端中央处贯通穿刺，挤出少量内容物后将盲肠原位推回至腹腔并缝合切口，健康对照组只开腹、关腹并复苏，不进行CLP。术后1 h 模型加药组参照文献［12］分别灌胃给药25、50、100 mg/kg β-榄香烯，健康对照组和模型组灌胃等量生理盐水，于术后12 h 和24 h 收集各组大鼠外周血。术后48 h断头法处死各组大鼠并收集肝脏组织，部分置于-80 ℃冰箱中冻存用于分子试验，剩余部分以4%多聚甲醛固定用于免疫组化和HE染色。

1.2.2 肝脏生化指标和功能检测 术后12 h和24 h分别取血，于4 ℃、3 000 r/min条件下离心15 min，取上清，通过全自动血清生化分析仪检测血清中天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷氨酸氨基转移酶（glutamate aminotransferase，ALT）、高 密 度 脂 蛋 白（high-density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、三酰甘油（triglyceride，TG）水平。同时收集外周血，按ELISA 试剂盒操作说明书测定血清和肝组织中iNOS和IL-10含量。

1.2.3 HE 染色观察肝脏组织病理损伤程度 取4%多聚甲醛固定的肝脏组织，石蜡包埋切片，经脱蜡水化后进行HE 染色，光镜下观察并拍照，记录组织形态学变化，细胞核呈蓝紫色，细胞质呈红色。随机选取10 个视野采用Knodell 评分法对各组大鼠进行肝脏组织病理损伤评分，评分标准：大鼠肝脏组织汇管区有无碎屑样坏死、肝小叶细胞是否变性和局灶坏死以及汇管区和肝小叶炎症程度，具体评分标准参照文献［11］。

1.2.4 Western blot 检测蛋白表达 取冻存的肝脏组织，于室温条件下解冻并研磨均匀，采用RIPA 蛋白裂解液于冰上提取肝脏组织总蛋白，BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度和纯度，每孔上样30 μg，经SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜、脱脂奶粉封闭后，加入一抗（1∶500），4 ℃摇床孵育过夜，回收一抗残留液，加入HRP 标记的对应二抗（1∶4 000），室温孵育2 h，采用ECL 化学发光法于暗室中曝光显影（GAPDH 作内参）。胶片扫描存档，Photoshop 整理去色，Alpha 软件分析光密度值，计算各组大鼠caspase-3、caspase-9 及p-P65/P65 蛋白相对表达量，结果以目的条带和内参GAPDH 比值表示，重复实验3次，最终结果取平均值。

1.2.5 免疫组化检测p-P65 表达水平 取4%多聚甲醛固定的肝脏组织，石蜡包埋切片，组织切片行抗原修复，加入内源性过氧化物酶，经血清封片后，加入一抗孵育过夜，再以二抗室温孵育60 min，加DAB 显色液，水洗终止显色，苏木素复染细胞核，脱水后中性树脂封片，显微镜下观察拍照，苏木素染细胞核呈蓝色，DAB 染阳性细胞呈棕黄色。采用IPP 软件分析肝脏组织染色的光密度值，取平均值表示肝脏组织中NF-κB P65的表达情况。

1.3 统计学分析 使用SPSS17.0 和GraphPad prism6.0 软件统计数据，正态分布的计量资料表示为。多组数据比较采用方差分析，两两比较采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-榄香烯对脓毒症大鼠血清中AST 和ALT 水平的影响 各组大鼠血清中AST 水平分别为（146±25）、（365±43）、（359±36）、（268±29）、（186±35）U/L，ALT 水 平 分 别 为（37±16）、（164±27）、（158±31）、（116±24）、（72±25）U/L。与健康对照组相比，模型组大鼠血清中AST 和ALT 水平明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，25 mg/kg β-榄香烯给药治疗后脓毒症大鼠血清中AST 和ALT 水平差异无统计学意义（F=3.211、3.098；P=0.095、0.102），经50、100 mg/kg β-榄香烯给药治疗后，脓毒症模型大鼠血清中AST和ALT水平显著降低（P＜0.05），见图1。结果提示：β-榄香烯可降低脓毒症大鼠血清中AST 和ALT 水平，改善脓毒症大鼠肝功能。

图1 各组大鼠血清中AST和ALT水平的变化Fig.1 Changes of AST and ALT levels in serum of rats in each group

2.2 β-榄香烯对脓毒症大鼠血清中LDL、HDL、TG水平的影响 各组大鼠血清中LDL 水平分别为（0.18±0.040）、（0.66±0.077）、（0.63±0.056）、（0.46±0.070）、（0.30±0.060）mmol/ml，HDL 水 平 分 别 为（1.42±0.01）、（0.46±0.14）、（0.50±0.10）、（0.79±0.22）、（1.19±0.17）mmol/L，TG 水平分别为（0.24±0.06）、（0.97±0.08）、（0.93±0.11）、（0.63±0.08）、（0.38±0.09）mmol/L。与健康对照组相比，模型组大鼠血清中LDL 和TG 水平明显升高，HDL 水平降低（P＜0.05）。与模型组相比，经25 mg/kg β-榄香烯治疗后，脓毒症大鼠血清中LDL、HDL、TG 水平差异无统计学意义（F=1.750、1.664、2.573；P=0.292、0.301、0.188），经50、100 mg/kg β-榄香烯治疗后，脓毒症大鼠血清中LDL 和TG 水平显著降低，HDL水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。提示β-榄香烯对脓毒症大鼠肝脏功能具有保护作用。

图2 各组大鼠血清中LDL、HDL、TG水平变化Fig.2 Changes of LDL，HDL and TG levels in serum of rats in each group

2.3 β-榄香烯对脓毒症大鼠肝脏病理损伤的影响 HE 染色结果表明，健康对照组大鼠肝脏组织结构正常，肝细胞大小均匀，汇管区和肝小叶结构正常，未见病理变化。模型组大鼠肝脏组织结构紊乱，肝细胞损伤严重，肝小叶结构不清，胞核消失，肝小叶和汇管区可见炎症浸润。与模型组相比，模型+β-榄香烯25 mg/kg 组肝脏组织病理损伤无明显变化。模型+β-榄香烯50 mg/kg 组大鼠肝脏组织结构较模型组有所改善，可见结构正常的肝细胞和肝小叶。模型+β-榄香烯100 mg/kg组大鼠肝脏组织结构正常，肝细胞大小均匀，未见炎症浸润，且肝脏病理损伤Knodell 评分依次为模型组＞模型+β-榄香烯25 mg/kg组＞模型+β-榄香烯50 mg/kg组＞模型+β-榄香烯100 mg/kg 组＞健康对照组，见图3。结果提示β-榄香烯可改善脓毒症大鼠肝脏组织病理损伤。

图3 各组大鼠肝脏组织HE染色（×400）Fig.3 HE staining of liver tissue of rats in each group（×400）

2.4 β-榄香烯对脓毒症大鼠肝脏组织中凋亡蛋白表达水平的影响 Western blot 结果表明，各组大鼠肝脏组织中cleaved cas9/cas9 蛋白表达水平分别为0.02±0.015、0.90±0.07、0.88±0.08、0.38±0.05、0.04±0.025，cleaved cas3/cas3 蛋白表达水平分别为0、0.94±0.09、0.30±0.06、0.06±0.03、0.02±0.015。与健康对照组相比，模型组大鼠肝脏组织中cleaved cas9/cas9 和cleaved cas3/cas3 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。与模型组相比，经25 mg/kg β-榄香烯给药处理后，cleaved cas9/cas9、cleaved cas3/cas3 蛋白表达水平差异无统计学意义（F=1.077、1.842；P=0.395、0.218），经50、100 mg/kg β-榄香烯给药处理后，cleaved cas9/cas9、cleaved cas3/cas3 蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。提示β-榄香烯通过抑制脓毒症大鼠肝脏组织中凋亡蛋白表达减少肝细胞凋亡。

图4 各组大鼠肝脏组织中cleaved cas9/cas9、cleaved cas3/cas3蛋白表达水平Fig.4 Protein expression levels of cleaved cas9/cas9 and cleaved cas3/cas3 in liver tissues of rats in each group

2.5 β-榄香烯对脓毒症大鼠血清及肝组织中iNOS和IL-10含量的影响 各组大鼠血清中iNOS含量分别为（20±5）、（187±35）、（179±30）、（132±28）、（58±10）pg/ml，IL-10 含 量 分 别 为（5±2.0）、（9±2.6）、（9.3±2.4）、（15±3.6）、（21±4）pg/ml；肝组织中iNOS含量分别为（13±5）、（99±13）、（92±16）、（68±15）、（31±9）pg/ml，IL-10 含 量 分 别 为（4±1.0）、（8.3±1.6）、（8.6±1.3）、（13.8±2.0）、（21.3±1.8）pg/ml。与健康对照组相比，模型组大鼠血清及肝组织中iNOS和IL-10 均高表达（P＜0.05）；与模型组相比，经25 mg/kg β-榄香烯给药治疗后，脓毒症大鼠血清及肝组织中iNOS 和IL-10 含量差异无统计学意义（F=2.672、1.980；P=0.091、0.124），经50、100 mg/kg β-榄香烯给药治疗后，脓毒症大鼠血清和肝组织中iNOS 含量明显降低，IL-10 含量增高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。提示β-榄香烯通过调控iNOS 和IL-10 含量水平在脓毒症大鼠血清和肝组织免疫系统中发挥调节作用。

图5 各组大鼠血清和肝组织中iNOS、IL-10蛋白表达水平Fig.5 Expression levels of iNOS，IL-10 protein in serum and liver tissue of rats in each group

2.6 β-榄香烯对脓毒症大鼠肝组织中p-P65/P65蛋白表达水平的影响 免疫组化和Western blot 检测各组大鼠肝组织中p-P65/P65 蛋白表达水平，图6B结果显示，各组大鼠肝组织中p-P65/P65 蛋白表达水平分别为4±3、32±7、30±8、16±6、11±5，图6C、D结果显示，p-P65/P65 蛋白表达水平分别为0.01±0.006、0.18±0.020、0.16±0.040、0.04±0.020、0.02±0.014。与健康对照组相比，模型组大鼠肝组织中p-P65/P65 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，经25 mg/kg β-榄香烯治疗后，脓毒症大鼠肝组织p-P65/P65 蛋白表达水平差异无统计学意义（F=1.334、P=0.305），50、100 mg/kg β-榄香烯显著降低脓毒症大鼠肝组织中p-P65/P65 蛋白表达水平，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6。提示β-榄香烯通过下调NF-κB P65蛋白表达在脓毒症大鼠肝组织中发挥调节作用。

图6 各组大鼠肝组织中p-P65/P65蛋白表达水平Fig.6 Expression level of p-P65/P65 protein in liver tissues of rats in each group

3 讨论

脓毒症与肝功能密切相关，两者相互制约，相互影响。脓毒症发生时，大量炎症介质、黏附分子释放导致肝脏功能衰竭，而肝脏又通过清除毒素、介导炎症反应和免疫反应发挥机体保护作用［13］。本研究通过建立脓毒症大鼠模型检测肝脏生化指标和肝脏病理损伤程度，结果显示，模型大鼠肝脏生化指标AST、ALT水平明显升高，血清中HDL水平降低，LDL 和TG 升高，肝脏组织病理损伤严重。兰天罡等［14］发现，β-榄香烯对肝癌患者肝功能具有明显改善效果。本研究结果显示，经β-榄香烯治疗后，脓毒症大鼠肝脏生化指标和肝功能异常指标明显降低，组织病理损伤得到改善，提示β-榄香烯对脓毒症大鼠肝功能具有保护作用，因此，β-榄香烯可能作为脓毒症肝损伤的潜在治疗药物。

为明确β-榄香烯保护脓毒症大鼠肝功能的作用机制，研究组分别检测了脓毒症大鼠血清和肝组织中凋亡蛋白、免疫调节因子及炎症水平。凋亡蛋白caspase9 和caspase3 是细胞凋亡重要的起始蛋白和执行蛋白，受外界信号刺激后，凋亡起始蛋白caspase9被异常激活，产生大量cleaved cas9并引起caspase 级联反应，活化的caspase9 起始下游的凋亡执行蛋白caspase3，caspase3被激活后进一步启动细胞凋亡途径［15］。高建芝等［16］发现，脓毒症大鼠肝组织中凋亡蛋白caspase3高表达，肝细胞凋亡异常增多。也有文献报道，脓毒症大鼠肝脏组织中凋亡蛋白高表达加剧脓毒症进展［17］。本实验结果显示，脓毒症大鼠肝脏组织中cleaved cas9 和cleaved cas3 均高表达，经β-榄香烯给药治疗后，脓毒症大鼠肝脏组织中cleaved cas9 和cleaved cas3 蛋白表达水平显著降低。提示β-榄香烯通过降低脓毒症大鼠肝脏组织中凋亡蛋白表达抑制细胞凋亡，缓解脓毒症大鼠肝损伤。

IL-10是炎症反应和免疫反应的抑制因子，能够抑制炎症细胞释放炎症因子，同时，IL-10 在抑制细胞因子产生、抗原呈递及T 细胞增殖过程中也发挥重要调控作用。LIANG 等［18］通过建立CLP 诱导的脓毒症大鼠模型，检测大鼠血清和肝脏组织中IL-10含量，结果表明，IL-10 在脓毒症大鼠血清和肝脏组织中低表达，经脂肪间充质干细胞分泌的sTNFR1治疗后，IL-10 含量明显升高。iNOS 是促进炎症和免疫反应的介导因子，激活iNOS可生成大量的NO，诱导机体氧化应激，促进炎症因子表达［19］。研究发现，iNOS 在脓毒症大鼠肝脏中高表达，抑制TLR4/NF-κB 通路可降低肝脏中iNOS 表达水平［20］。本研究结果显示，脓毒症大鼠血清和肝脏中IL-10 和iNOS 均高表达，经β-榄香烯治疗后，脓毒症大鼠血清和肝脏中IL-10 含量增多，iNOS 含量降低。提示β-榄香烯通过调节脓毒症大鼠血清和肝脏中IL-10和iNOS含量调控大鼠免疫反应和炎症反应。

研究表明，脓毒症大鼠肝损伤及炎症反应与核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路密切相关［21-22］。为进一步明确β-榄香烯调节脓毒症大鼠肝脏中凋亡蛋白、炎症因子和免疫调节因子表达水平的作用机制，本实验检测了脓毒症大鼠肝脏细胞中NF-κB P65 蛋白表达水平，NF-κB 是细胞内重要的核转录因子，NF-κB蛋白家族常参与细胞炎症反应、凋亡、免疫应答等过程［23］。NF-κB 激活通常是指P65 磷酸化后，NF-κB 从胞质转移至胞核中从而启动下游靶基因转录，如TNF-α、IL-6、iNOS 等［24］。本实验结果显示，脓毒症大鼠肝脏细胞中p-P65/P65蛋白表达水平异常增高，经β-榄香烯给药治疗后，脓毒症大鼠肝脏细胞中p-P65/P65 蛋白表达水平显著降低，结果表明，β-榄香烯可抑制NF-κB P65通路蛋白表达，结合前期研究结果提示，β-榄香烯通过抑制NF-κB P65 蛋白表达缓解脓毒症大鼠因细胞凋亡、炎症反应和免疫失调引起的肝损伤。

综上所述，β-榄香烯在脓毒症大鼠肝损伤中具有调节作用，其作用机制可能是通过抑制NF-κB P65 通路下调凋亡蛋白、炎症因子和免疫调节因子水平。