Tet1对海分枝杆菌感染过程中宿主炎症反应及肥大细胞活化的影响①

丁才荣 韩珊珊 张 丁 闻 馨 宋璟瑞 杜德兵 李 丹 王德成

（三峡大学医学院，三峡大学感染与炎症损伤研究所，宜昌 443002）

结 核 分 枝 杆 菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是造成人或动物结核病（tuberculosis，TB）的病原体［1］，其传染性和致病性强，相关研究需在生物安全3 级实验室操作，导致MTB-宿主相互作用的研究及其进展缓慢［2］。海分枝杆菌（Mycobacterium marinum，Mm）是一种机会致病菌，与MTB的遗传背景最为相似，在天然宿主如斑马鱼体内可产生类似干酪样肉芽肿的典型病变［3-4］；且CARLSSON 等［5］研究证实，Mm可通过小鼠尾静脉建立感染并形成肉芽肿样病变。Mm可入侵巨噬细胞，阻止吞噬体-溶酶体融合，并在巨噬细胞内潜伏增殖，感染了Mm的巨噬细胞在TNF-α 诱导产生的线粒体活性氧（ROS）和亲环蛋白D 的参与下触发受感染细胞的程序性坏死，致使细菌大量扩散增殖［6-7］。此外，Mm和MTB产生毒力均需ESX-1 分泌系统的参与，二者具有共同的毒力途径，诸多优点使Mm越来越多地应用于分枝杆菌致病机制的研究［8-10］。

Tet1（tet methylcytosine dioxygenase 1）是一种依赖Fe2+和α-酮戊二酸的双加氧酶，可将5-甲基胞嘧啶（5-mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）以调节多种表观遗传反应［11］。研究发现，Tet1在肿瘤、发育、细胞增殖和感染等多种病理生理过程中发挥重要作用［12］。幽门螺杆菌既能通过谷氨酰转移酶上调Tet1表达以活化Wnt 信号通路，也能通过毒力岛CagA 调控Tet1介导的DNA 甲基化导致KLF4 失活，最终促进胃癌的发生发展［13-14］。前期通过Mm的Tet1-/-小鼠尾静脉感染模型发现，Tet1-/-小鼠既能显著降低菌载量，又能有序控制组织病理损伤，但Tet1如何“平衡”免疫应答与组织损伤的内在机制尚不明确［15］。肥大细胞（mast cells，MCs）是重要的免疫细胞，主要分布于与外界环境相通的组织中［16］。CARLOS 等［17］通过H37Rv 的小鼠感染模型发现MCs可通过分泌细胞因子发挥抗结核免疫反应。虽然已有文献表明MCs 的活化对抗分枝杆菌感染至关重要，但细菌感染过程中MCs 活化的调控及其机制尚需深入研究。综合已有的关于Tet1的研究报道，本研究拟通过建立Mm的Tet1基因敲除小鼠尾静脉感染模型，初步探究Mm感染过程中MCs的活化，明确Tet1调控MCs活化对宿主抗菌免疫的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与菌株 SPF 级野生型C57BL/6 小鼠购自三峡大学实验动物中心，SPF 级C57BL/6 背景的Tet1+/-小鼠由中国科学院水生生物研究所肖武汉研究员课题组提供［18］。Tet1+/-与野生型C57BL/6 杂交后，将鉴定的Tet1+/-小鼠进行雌雄配对，获得Tet1+/+与Tet1基因全身敲除小鼠（Tet1-/-）。所有小鼠饲养于M1型小鼠饲养笼，温度20～24 ℃，湿度55%～65%，光照（12 h 明暗交替），食用小鼠标准颗粒饲料和纯净水。自由饮水和摄食，并定期更换垫料。Mm由华盛顿大学LALITA RAMAKRISHNAN 教授馈赠，由本课题组保种传代［19］。

1.1.2 主要试剂与仪器 Triton-X、牛血清白蛋白（BSA）、DEPC水、甲苯胺蓝试剂盒购自索莱宝公司；吐温-80、20×PBS 缓冲液、4%多聚甲醛组织固定液购自上海生物工程有限公司；Middlebrook 7H9 细菌液体培养基、OADC 细菌营养液购自BD 公司；抗酸染色试剂盒购自武汉塞维尔生物科技有限公司；抗肥大细胞类胰蛋白酶（Tryptase）一抗（ab2378）购自Abcam 公司；5 羟色胺（5-HT）兔抗鼠单克隆抗体购自博士德生物工程有限公司；电动组织研磨器购自天根生化科技有限公司。透射电子显微镜HT-7500购 自HITACHI 公 司；Olympus 显 微 镜（Olympus BX63）及Cellsens 图像分析系统购自Olympus 公司；Multiskan Spectrum 全波长酶标仪购自Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1Mm的培养与处理方法

1.2.1.1 细菌复苏 将保种于-80 ℃冰箱中的Mm于室温解冻，取适当菌液（体积视菌浓度而定）于含10%OADC 的7H9 细菌液体培养基中，置于32 ℃、100 r/min的摇床中避光培养7～9 d，直至对数生长期（OD600=0.6～1.0）。

1.2.1.2 单细菌制备 当Mm生长至对数生长期时，取出菌液于50 ml 离心管中，4 000 r/min 离心20 min，弃上清，加入1 ml 含10%OADC 的7H9 细菌液体培养基，振荡混匀，随后吸取200 μl细菌重悬液分装至1.5 ml无菌EP管中，再加入1 ml 7H9液体培养基，然后使用1 ml 注射器来回吹散细菌（15～20 次），100 g 离心1 min，细菌悬液用5 μm 滤膜过滤后分装至1 ml冻存管，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.1.3 细菌处理 实验前从-80 ℃冰箱中取出单细菌菌液，在4 ℃冰箱解冻后10 000 r/min 离心10 min，弃上清，加入无菌PBS 溶液重悬细菌，通过测定细菌重悬液的OD 值换算出需要注射给小鼠的菌液体积。

1.2.2 构建小鼠Mm尾静脉感染模型 SPF 级雌性Tet1+/+小鼠及Tet1-/-小鼠各30只，预饲养7 d后，将两种小鼠随机分为空白对照组（8 只）和Mm感染组（22 只）。在无菌条件下尾静脉注射100 μlMm菌液，每只小鼠尾部注射菌量均为3×107CFU，空白对照组小鼠注射等体积的PBS溶液。每天固定时间观察拍照小鼠尾组织病变情况，并测量小鼠尾部病变面积。感染第20 天时，颈椎脱臼法处死各组小鼠，收集小鼠尾巴进行后续实验研究。

1.2.3 尾组织载菌量检测 取小鼠尾组织病变部位，PBS 溶液漂洗，使用电动匀浆器在含0.1% Triton-X（1×Triton-X 原液经无菌PBS 稀释）的无菌PBS溶液中将组织匀浆后，将组织悬液用PBS 连续倍比稀释并均匀涂在含10%OADC 的7H10 固体培养平板上，置于32 ℃培养箱避光培养8～10 d，计单个菌落数，小鼠尾组织菌载量表示为CFU/g组织。

1.2.4 HE 染色 将小鼠组织置于4%多聚甲醛固定液，4 ℃放置6～24 h，随后将组织转移至75%乙醇，进行组织修块；修好的组织按照以下乙醇浓度进行梯度脱水：70%乙醇30 min、80%乙醇1 h、90%乙醇1 h、95%乙醇1.5 h、无水乙醇Ⅰ30 min、无水乙醇Ⅱ30 min 至完全脱水；随后依次置于二甲苯Ⅰ30 min，二甲苯Ⅱ30 min进行透明；完成脱水的组织经石蜡处理后，将组织块置于熔点为60 ℃的石蜡中包埋；切片机将蜡块切成约4 μm 厚的连续切片，置于37 ℃烘箱中6～8 h，后续常温避光保存备用。制备好的切片按照下列顺序脱蜡：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇各浸入10 min，随后浸入80%乙醇5 min、70%乙醇5 min，然后浸置于蒸馏水中；苏木精复染3 min，流水冲洗30 min，伊红染色2 min，盐酸乙醇分化，常规梯度乙醇脱水至透明；切片自然风干，中性树脂封片。

1.2.5 抗酸染色 切片脱蜡参照HE 染色步骤。将已固定的切片滴加石碳酸复红溶液染色5 min，蒸馏水冲洗脱色后，亚甲基蓝溶液复染30 s，常规梯度乙醇脱水至透明，自然风干后封片。

1.2.6 甲苯胺蓝染色 将石蜡切片浸入二甲苯2 次，15 min/次，不同浓度的乙醇各浸没1 min，流水冲洗2～3 min；Toluidine Blue O Stain 中浸染30 min，流水冲洗2～3 min，用滤纸吸干水分或直接晾干；95%乙醇分色至背景呈淡蓝色，在镜下控制分色效果；再用无水乙醇脱水1 min，二甲苯透明2 次，每次2 min，中性树胶封固。MC 颗粒呈红紫色，胞核呈蓝色。

1.2.7 免疫组织化学染色 切片脱蜡参照HE 染色步骤。将切片置于修复盒，加入柠檬酸盐缓冲溶液，液面要浸没组织，沸水浴20 min 修复后取出，冷却至室温，PBS 润洗2 min；将3%的过氧化氢滴于组织片，室温放置15 min，PBS 冲洗2 min，5%BSA 37 ℃封闭15 min；甩掉不洗，滴加相应一抗，4 ℃孵育过夜；次日二抗室温孵育1 h，用新鲜配制的DAB显色液显色，蒸馏水冲洗3 次，梯度乙醇脱水至透明，通风橱中风干，中性树脂封片。

1.2.8 透射电镜超微结构切片及染色 将小鼠尾部病变组织置于2.5%戊二醛固定液中固定，待充分固定后，制成超薄切片，然后在干净的培养皿内放置蜡板，将醋酸铀染液滴在蜡板上，将载有切片的载网覆于染液上（切片面接触染液）染色15～30 min，蒸馏水冲洗切片，滤纸吸干，再将载网覆于柠檬酸铅染液上染色5～10 min，蒸馏水冲洗切片，吸干，置于洁净的培养皿内备用，电镜观察。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 4.0 软件作图并进行数据分析，数据用表示，数据分析采用独立样本t检验，统计分析图为3次生物学重复实验结果，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠感染Mm后尾组织病变情况Tet1+/+与Tet1-/-小鼠尾静脉接种等量细菌后，观察记录小鼠尾组织大体病变（如脓肿形成等）情况。如图1A、B 所示，Tet1+/+组小鼠在接种Mm后出现肉眼可见的皮肤破损，且随着试验周期的延长，组织病变呈进行性进展，溃烂面积逐渐增大，部分小鼠尾部创面化脓坏死，而Tet1-/-组小鼠尾部仅有轻微肿胀，脓肿程度明显较Tet1+/+小鼠轻。菌载量计数发现Tet1+/+小鼠尾组织中细菌数量逐渐增多，而Tet1-/-小鼠菌载量呈递减趋势（图1C），差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 小鼠感染Mm 后尾组织大体病变、脓肿面积及菌载量比较Fig.1 Comparison of tail gross lesions，abscess area and bacteria loading after infection with Mm

2.2 小鼠尾组织HE 染色病理形态学观察 小鼠接种细菌第20 天，取尾组织制作病理学切片，检查炎症细胞浸润和肉芽肿的形成。镜下观察发现，Tet1+/+小鼠感染Mm后尾组织局部有明显肿胀，炎症细胞大量浸润，伴局灶性坏死，有典型肉芽肿样病灶形成（图2C），而Tet1-/-小鼠仅出现少量炎症细胞，小鼠尾组织病变明显较轻（图2D）。提示Tet1的缺失可明显缓解小鼠尾组织损伤程度。

图2 小鼠感染Mm后尾组织病理学观察（×200）Fig.2 Histopathology examination of mice tails after Mm infection（×200）

2.3 小鼠尾组织抗酸染色观察 抗酸染色发现Tet1+/+小鼠感染后分布有大量红色杆菌，而Tet1-/-小鼠仅观察到少许细菌分布（图3）。此结果提示Tet1的缺失可增加机体抗菌及清除细菌的能力。

图3 小鼠尾组织抗酸染色病理形态学观察（×1 000）Fig.3 Pathomorphological observation of mice tail tissue by acid-fast staining（×1 000）

2.4 超微组织病理学观察 比较Tet1+/+和Tet1-/-小鼠感染Mm后尾组织超微病理结构，二者有明显的形态差异。观察发现，Tet1+/+小鼠尾组织包含大量细菌，成团或分散存在，菌体细胞壁光滑无皱，电子密度较高（图4A、C）；相反，Tet1-/-小鼠体内细菌菌体皱缩，折光性降低，细菌主要集中在吞噬体周围（图4B、D）。提示Tet1缺失后宿主更易募集大量细菌，促使吞噬细胞对细菌的吞噬、消化，帮助宿主抵抗Mm的入侵。

图4 小鼠尾组织病变组织超微病理学观察Fig.4 Ultrahistopathology observation of tail lesions in mice

2.5 MCs 的分布及形态变化 小鼠接种细菌第20 天，甲苯胺蓝染色观察小鼠尾组织中MCs的形态及数量差异（图5A）。结果显示，与Tet1+/+小鼠相比，Tet1-/-小鼠接种Mm后皮肤炎症程度明显较轻，MCs胞体较小且密度降低，脱颗粒细胞少见，其主要分布于组织表皮层区域，而Tet1+/+小鼠尾组织表皮层和真皮层均可见大量弥散分布的MCs。镜下各计数100 个MCs，Tet1+/+小 鼠MCs 脱 颗 粒 数 明 显 多 于Tet1-/-小鼠（图5B）。提示Tet1可诱导MCs 活化，促进MCs脱颗粒。

图5 小鼠感染Mm后尾部病变组织MCs观察Fig.5 Observation of MCs in tail lesions of mice after infected with Mm

2.6 免疫组织化学染色观察及统计 免疫组化染色技术检测发现，Tet1+/+小鼠尾组织中类胰蛋白酶和5-HT阳性信号较强，且主要分布在炎症区域；相反，在Tet1-/-小鼠尾组织中几乎检测不到这两种介质的表达。进一步统计分析发现，Tet1+/+小鼠尾组织中类胰蛋白酶和5-HT 的表达明显高于Tet1-/-小鼠，差异有统计学意义（图6）。

图6 小鼠感染Mm 后尾组织中类胰蛋白酶和5-HT 表达与分布Fig.6 Expressions and distribution of tryptase and 5-HT in mice tail tissues after infection with Mm

3 讨论

MCs是参与结核病病理损伤的主要炎症细胞之一，其通过直接接触或释放介质间接参与分枝杆菌急性和慢性感染状态［20］。在分枝杆菌感染早期，主要是先天免疫反应发挥作用，当机体接触到分枝杆菌时，细菌移位到黏膜屏障，与包括MCs 在内的各种免疫细胞相互作用，导致促炎介质的释放［21］。结核杆菌不仅能通过细胞壁脂类成分如ESAT-6 和MPT-63 等活化MCs，也能分泌过氧化氢酶抑制MCs胞外诱捕网的形成以逃逸宿主免疫识别与杀伤［22-23］。研究报道，MTB可通过胆固醇依赖途径入侵MCs，促使MCs 活化脱粒，并通过脂筏将细菌内化［23-24］。本实验通过组织病理学观察发现，感染了Mm的小鼠尾组织MCs 脱颗粒数增加，并伴随大量炎症细胞聚集，表明MCs 在Mm感染早期即可诱发炎症反应，从而抑制细菌增长，对宿主发挥重要保护作用。细菌病原体可结合多种受体激活MCs，如大肠杆菌细胞壁脂多糖可通过TLR4 依赖途径激活MCs，促使TNF-α 和IL-6 的产生［25］；金黄色葡萄球菌蛋白A 可与结合在FcεRI 上的IgE 不同区域相互作用以诱导MCs 释放炎症介质［26］。本研究中，Mm的入侵导致小鼠体内MCs 大量活化，类胰蛋白酶和5-HT 表达量明显增加，这有助于宿主在早期感染中有效清除细菌。有研究证实，MCs 的过度激活与哮喘、自身免疫性关节炎等过敏性和炎症性疾病的发生密切相关［27-28］。本研究中，Mm感染后导致MCs大量活化，MCs 脱粒释放的炎症介质既能诱导免疫应答，同时大量释放的递质又能导致炎症病理损伤，提示在抗细菌感染的免疫应答中，MCs 的激活与脱颗粒释放炎症介质具有“双刃剑”效应：其可帮助宿主抵抗细菌入侵，参与宿主炎症反应及杀菌效应，但MCs的过度活化反而会加重宿主免疫损伤。

研究发现，Tet1不仅能调控树突状细胞激活参与过敏性鼻炎的发生，还能作为巨噬细胞活化后释放TNF-α 的转录调控因子［29-30］。在过敏性气道炎症模型中发现，Tet1-/-小鼠表现为气道高反应性和肺嗜酸性粒细胞增多，表现出比Tet1+/+小鼠更严重的疾病状况［31］。在本研究中，Tet1+/+细菌载量明显较Tet1-/-小鼠高，病变更严重，随着感染时间的延长，宿主发挥抗菌免疫，帮助机体清除细菌，尾组织超微结果显示，Tet1的存在可削弱宿主对细菌的吞噬能力，帮助细菌扩散增殖，但其具体机制仍需继续探索。

Tet1可通过调节促炎细胞因子基因启动子中的5-羟甲基化来促进巨噬细胞的激活，也可与THP-1和树突状细胞相互作用影响炎症发展［30，32］。然而，在抗分枝杆菌感染过程中，Tet1是否参与MCs 活化的调控仍是未知的。本研究中，Tet1+/+小鼠尾组织中大量MCs 活化且表现出脱颗粒行为，而Tet1-/-小鼠仅有少量MCs 发生脱颗粒，且组织病理损伤明显减轻，提示分枝杆菌感染过程中Tet1可能通过某种机制增强了MCs 的活化，进而协同MCs 活化并释放炎症介质，但该过程的详细机制仍需继续探索。有研究表明，Tet1的缺失会导致感染牙卟啉单胞菌后，宿主NF-κB 信号通路的活性下调，且IL-6、CCL2 的产生也随之减少［33］。本实验中，Tet1+/+小鼠尾部损伤呈渐进性发展，炎症性病变严重，镜下见大量MCs 被激活；而Tet1-/-小鼠尾组织炎症细胞的募集明显受到损害，小鼠组织炎症损伤得到控制，即炎症介质的阳性表达明显降低。此外，Tet1可调控牙周疾病炎症过程中巨噬细胞的活化，同时也在低氧诱导的炎症调节中发挥关键作用［33-34］。课题组猜测，在Mm感染过程中，Tet1可能可以参与调控MCs 的活化及炎症介质的释放，参与机体的抗菌免疫。以上结果表明Tet1的缺乏会“适度”调节分枝杆菌感染过程中的炎症病理损伤，平衡抗菌免疫反应和炎症病理损伤在一定范围内有序进行，尤其是Tet1具有重要的表观遗传调控功能，但其在抗分枝杆菌感染过程中的重要作用及其详细机制尚需要进一步深入。

本研究通过建立Mm的小鼠尾静脉感染模型，比较了Tet1+/+和Tet1-/-小鼠感染细菌后大体病变、菌载量、组织病理学等多方面的差异；同时，也探讨了Tet1对MCs 活化与脱颗粒行为的影响。结果发现Tet1的缺失能有效缓解组织损伤，这种保护效应可能与Tet1能调控MCs 的活化和脱颗粒存在一定的内在关联，但Tet1调控MCs 活化的具体机制及其在感染性疾病中所发挥的作用仍需进一步探索。