雄激素受体基因慢病毒干扰载体的构建及在肝癌细胞中的表达①

陆灵松 沈梅玲 祝珊珊 刘 敏 毕丽伟 李海浪 秦 飞 李 杰

（厦门医学院药学系药物检测中心，厦门 361026）

雄激素受体（androgen receptor，AR）是一种激素诱导型的DNA 结合转录因子，属于类固醇受体家族成员，在生物体的器官发生、生理和病理中发挥关键性作用［1-4］。研究发现AR 的紊乱激活与多种肿瘤的发生发展有关，如前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌及胶质瘤［5-10］。AR在肿瘤中发挥的作用主要是通过与其他信号通路发生广泛关联，由上游信号转导进入细胞核内，激活下游与癌症相关基因表达，如CyclinD1、PI3K/AKT 信号 及Hippo mTOR 信 号 等。特别是在PI3K/AKT 通路中，有研究显示，在前列腺癌的发生过程中，PTEN 信号的突变或缺失可能为AR 和PI3K/AKT 信号的关联提供了便利［11-12］。本研究通过构建3 对shRNA 干扰的AR 慢病毒载体，利用慢病毒感染肝癌细胞Hep3B 抑制细胞内AR 的表达，并验证在肝癌细胞中AR 的活性与PI3K/AKT/PTEN 信号通路是否有关，为以雄激素-AR 信号轴作为肿瘤细胞内生物学靶点的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 pLKO.1-GFP-puro、慢病毒重组穿梭质粒和包装质粒（pVSVG 和pHR）购自厦门生命互联生物科技公司；PCR 引物由江苏金维智生物有限公司合成；AR 寡核苷酸链及shRNA 质粒测序由厦门纽克泰公司完成；DNA Marker、cDNA 反转录试剂盒及限制性内切酶AgeⅠ和EcoRⅠ、T4DNA连接酶等购自Fermentas 公司；DNA 提取试剂盒和胶回收试剂盒购自天根；DMEM、1640 培养基、胎牛血清（FBS）和青、链霉素购自Hyclone 公司；Trizol、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR 试剂购自Thermo Fisher；Western blot抗体AR（ab198394）、PTEN（ab32199）购自Abcam，p-AKTs473（#4060）购自CST；人胚肾细胞HEK-293T，肝癌细胞HepG2、Bel-7402、Hep3B、Huh-7以及正常肝细胞LO2 均来自本实验室液氮罐内冻存细胞。

1.2 方法

1.2.1 AR-shRNA 慢病毒干扰载体的构建 以人AR（GeneBank：NM20132.1）基因设计3 条特异性shRNA 序列和1 条阴性对照序列，合成表达shRNA的互补单链，分别为AR-shRNA-F1R1、AR-shRNAF2R2、AR-shRNA-F3R3。互补序列如表1 所示，其中画线部分为反义互补序列，两端为保护碱基及AgeⅠ和EcoRⅠ双酶位点。

表1 AR慢病毒质粒序列引物Tab.1 Primer sequences for AR lentiviral interference plasmid

引物由厦门纽克泰公司合成后，经退火反应，再同pLKO.1-GFP-puro空载体以限制性内切酶AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切，再通过T4DNA连接酶将AR-shRNA片段与载体连接，4 ℃过夜，转化到大肠杆菌DH5α内，24 h 后对阳性菌进行菌落PCR 合成扩增后（引物如表2 所示），进行DNA 电泳、酶切鉴定和测序，最终获得的阳性质粒命名为pLKO.1-AR-shRNAF1R1、pLKO.1-AR-shRNA-F2R2、pLKO.1-AR-sh-RNA-F3R3。其中测序引物采用pLKO 的通用测序引物进行扩增。

表2 AR shRNA载体的PCR引物Tab.2 PCR primer of AR shRNA vector

1.2.2 慢病毒包装与病毒滴度测定 293T 细胞接种到6 cm 细胞培养皿中培养24 h，使用Lipo3000 转染试剂分别将3 对AR 干扰质粒和阴性对照质粒以及包装质粒（pVSVG、pHR）加入细胞。转染48 h后，更换新鲜的DMEM培养液（10%的胎牛血清，1 μg/ml嘌呤霉素，1×105U/L 的青霉素及100 mg/L 的链霉素），收集293T 细胞内富含慢病毒颗粒的上清液，0.45 μm 滤器过滤病毒上清液并进行超速离心，获得慢病毒浓缩液，分装后置于-80 ℃冰箱。采用流式细胞计数荧光细胞法测定各组的病毒滴度，293T细胞采用3.5 cm 盘铺板，每盘1×105个细胞。利用不同浓度的病毒上清感染相同数量的293T 细胞，48 h后经流式细胞荧光数检测，利用公式：病毒滴度=感染时细胞数（个）×阳性细胞（%）/病毒液体积（ml）计算病毒滴度。各组病毒滴度如表3所示，3组慢病毒的病毒滴度均为2×108TU/ml。

表3 AR慢病毒滴度测定Tab.3 Titer detection of AR lentivirus

1.2.3 Real-time PCR 检测肝细胞内基因表达 培养肝细胞LO2，肝癌细胞HepG2、Hep3B、BEL-7402、7702，待细胞长满10 cm 盘后，采用Trizol 法提取细胞内mRNA，利用试剂盒反转录为cDNA，检测各组细胞内AR 表达。同样的方法检测慢病毒转染细胞后AR 表达。RT-PCR 引物设计：AR 正向引物5'-CGCAGGCAAGAGCACTGAAGA-3'，反 向引 物5'-ACCACCACCACACGGTCCATA-3'，内 参GAPDH 正向引物5'-TGACCACAGTCCATGCCATCA-3'，反向引物5'-CGCCTGCTTCACCACCTTCTT-3'，利用2-ΔΔCt法计算目的基因的mRNA相对表达水平。

1.2.4 Western blot 检测蛋白表达 培养肝细胞LO2，肝癌细胞HepG2、Hep3B、BEL-7402、Huh-7，待细胞长满10 cm 盘后，利用RIPA 法提取细胞内蛋白，BCA 法测定总蛋白浓度。制备10% 的SDSPAGE 蛋白胶，每孔蛋白上样量为30 μg，经电泳、转膜、2%脱脂奶粉封闭，并按照AR 一抗（1∶1 000），PTEN 一抗（1∶4 000），p-AKT（1∶2 000）进行4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h 后，曝光显影，得到蛋白表达实验结果。

1.2.5 病毒感染 将肝癌细胞内AR 表达较高的Hep3B 细胞作为AR 慢病毒干扰细胞株。Hep3B 细胞传代于10 cm 细胞培养皿，待细胞24 h 贴壁后加入慢病毒上清液进行RNA 干扰。24 h 后更换新鲜培养基，48 h 后荧光显微镜下观察GFP 表达效率。将加入的不同质粒的病毒上清液细胞分别命名为Hep3B-shAR1、Hep3B-shAR2、Hep3B-shAR3。Hep3B细胞提取RNA 和蛋白进行后续分析，得到AR mRNA 和蛋白表达结果，同时鉴定AR 干扰后PTEN的蛋白表达情况。

1.3 统计学处理 本实验数据以表示。数据采用GraphPad Prism 6.0 进行单因素方差分析，P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AR 慢病毒干扰质粒的构建及测序鉴定 慢病毒载体pLKO.1GFP 经过酶切的片段在DNA 电泳中的条带大小为8 kb（图1A）。经过连接酶连接后的3 条AR shRNA 干扰质粒和空白对照重组质粒，经转化后得到阳性菌，经质粒抽提后电泳结果如图1B 所示，4 个重组质粒条带大小正确，送公司测序鉴定，结果显示3 个AR shRNA 慢病毒载体构建成功（图1C）。

图1 RA干扰序列连接pLKO.1载体并测序Fig.1 RA interference sequence was linked to pLKO.1 vector and sequenced

2.2 AR 重组慢病毒质粒的包装 慢病毒质粒在293T细胞内包装，细胞加药筛选3周后，经单克隆形成的4 组293T 细胞在荧光显微镜下拍照，结果显示强烈的绿色荧光（图2）。

图2 293T细胞病毒包装（荧光和常光，×10）Fig.2 Virus packaging in 293T cells（fluorescent & white light，×10）

2.3 不同肝癌细胞内AR 表达 利用RT-PCR 和Western blot 检测肝细胞LO2，肝癌细胞HepG2、Hep3B、BEL-7402、Huh-7 内AR 的基因和蛋白表达情况。结果如图3 所示，Hep3B 细胞内的AR mRNA和蛋白水平表达高于其他肝细胞。选择Hep3B 细胞进行AR基因沉默实验。

图3 5株不同肝细胞内AR的表达情况Fig.3 AR expression in 5 hepatomas cells

2.4 AR 慢病毒感染Hep3B 细胞效果 将包装好的慢病毒液体以相同滴度加入Hep3B 细胞，48 h 后在荧光显微镜下的绿色荧光蛋白表达如图4A所示；Western blot 检测3 个质粒的干扰效率，如图4B 所示，pLKO.1-AR-shRNA-F3R3 慢病毒的AR 蛋白表达水平与对照组相比明显减弱。mRNA 表达效率如图4C 所示，pLKO.1-AR-shRNA-F2R2和pLKO.1-ARshRNA-F3R3 的AR mRNA 与对照组相比表达降低，其中F3R3 的mRNA 干扰效率较对照组相比降低达50%。

图4 AR干扰Hep3B细胞后AR的表达情况Fig.4 AR expression after lentivirus affect in Hep3B cells

2.5 AR 沉默对PTEN 信号及p-AKT 表达的影响Hep3B 细胞AR 基因敲减48 h 后，Western blot 检测细胞内蛋白表达，结果如图5所示，AR 基因敲减后，PTEN 蛋白表达升高，p-AKT 蛋白表达降低（P＜0.05）。提示AR对PTEN/ATK 信号通路的表达有影响，具有相关性。

图5 Hep3B细胞AR干扰后PTEN和p-AKT蛋白表达Fig.5 PTEN and p-AKT protein expressions after AR interference in Hep3B cells

3 讨论

AR 是与雄激素一起参与生命活动调节代谢的DNA 转录因子，当雄激素与AR 结合后调节下游靶基因活性，对肌肉、骨骼、第二性器官的发育和维持以及其他组织的发育具有重要作用。雄激素和AR信号轴的紊乱表达与多种肿瘤相关的信号通路有关，如TGF-β、β-catenin、FOXA1 信号等［13-14］。近年利用RNAi 技术或shRNA 沉默靶基因表达的方式已经成为研究肿瘤基因靶向治疗的重要工具，而利用shRNA 干扰基因时的脱靶效应会低于siRNA 转染［15-16］。本研究成功构建了3 条AR 慢病毒干扰质粒。

肝癌是目前世界上致死率较高的癌症之一，有研究发现男性患肝癌的比例比女性高2.5～11.1倍，而雄激素与AR 的作用在这一比例中发挥巨大影响［17-19］。尽管一些研究已经揭示了雄激素/AR 信号轴与肝癌发病率间的相关性，但一些机制仍不明确。本研究利用5 个肝细胞系中AR 基因表达水平较高的Hep3B细胞为载体，通过RNA 干扰技术诱导AR 蛋白低表达，检测了PTEN/AKT 信号通路中相关蛋白的表达情况，发现在肝癌细胞中敲减AR 后，能激活PTEN 蛋白表达，并下调磷酸化AKT蛋白表达。PTEN 是一个抑癌基因，通常与PI3K/AKT 信号通路活性相关。有研究显示在癌细胞状态下PTEN 基因一般属于缺失或突变状态，而PI3K/AKT 信号与AR表达呈正相关。本研究降低了肝癌细胞Hep3B 内AR 的表达，激活了PTEN 表达，说明AR 与细胞内PTEN 的表达可能存在某种负反馈作用，由于AR 在细胞中的作用需要通过与雄激素结合到达细胞核才能发生，因此这种作用是否直接依赖AR 的表达目前尚不明确。课题组后续将通过雄激素与AR 干扰载体结合来进一步确认AR 与PTEN/AKT 信号通路间的调控机制，为阐明AR与PTEN/AKT信号通路的作用机理提供更详细的依据。