经典名方保阴煎HPLC指纹图谱的建立及多成分含量测定方法研究

张曼，李秋晗，谢静，王佳慧，吴修红，闫广利，李丹，王喜军*

(1.黑龙江中医药大学 教育部经典名方有效性评价及产业化开发工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150040；2.京津冀联创药物研究(北京)有限公司，北京 100025)

保阴煎源于明代张景岳著《景岳全书》，由生地黄、熟地黄、白芍、黄柏、黄芩、川续断、山药和甘草组成，具有滋阴清热、固冲止血的功效，现代临床用于治疗月经病[1-4]、妊娠病[5-7]、产后病[8-9]、妇科杂症[10-12]等,疗效确切。保阴煎现收录于国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录(第一批)》，可按照现行中药注册3.1类新药要求通过简化注册程序研发古代经典名方保阴煎复方制剂。

按照古代经典名方复方制剂的研发要求，首先需研究制定经典名方基准样品的质量标准，作为参照标准，优化确定制剂生产工艺和制剂质量标准，保障与传统汤剂安全性和临床疗效的一致性。经典名方基准样品的质量评价，需要综合考虑药材-饮片-基准样品-制剂的相关性以及与临床疗效的相关性，采用指纹图谱或特征图谱、多成分含量测定等整体控制方式。本研究前期利用中医方证代谢组学技术筛选了保阴煎治疗功能性子宫出血的药效物质基础，发现5-羟甲基糠醛、小檗碱、黄芩苷、芍药苷与功能性子宫出血生物标志物高度关联，是保阴煎表达临床疗效的潜在药效物质基础[13]。5-羟甲基糠醛来源于君药地黄，具有抗氧化[14]、降低雌二醇及孕酮含量和抑制排卵[15]等药理作用；芍药苷来源于臣药白芍，具有镇痛[16]、抗炎[17]、抗抑郁[18]等药理作用；小檗碱来源于臣药黄柏，具有抗菌抗炎、降血压[19]等药理作用；黄芩苷来源于佐药黄芩，具有抗炎、抗氧化、抗抑郁、抗肿瘤等[20]药理活性。因此，本研究利用高效液相色谱法建立保阴煎基准样品的指纹图谱，并参照中药质量标志物属性[21]，选择5-羟甲基糠醛、小檗碱、黄芩苷、芍药苷4个与疗效相关且体现配伍的指标成分建立同时含量测定方法，为经典名方保阴煎基准样品质量标准的制定提供方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪-光电二极管阵列检测器(e2695-2998，美国Waters公司)；十万分之一电子分析天平(CP-225D，德国SARTORIUS公司)。

1.2 试药

5-羟甲基糠醛对照品(批号：111626-201912，含量以99.2%计)、芍药苷对照品(批号：110736-202044，含量以96.8%计)、盐酸小檗碱对照品(批号：110713-202015，含量以85.9%计)、黄芩苷对照品(批号：110715-201720，含量以93.5%计)、没食子酸对照品(批号：110831-201605，含量以98.5%计)、甘草苷对照品(批号：111610-201607，含量以96.8%计)、绿原酸对照品(批号：110753-201817，含量以96.8%计)、盐酸黄柏碱对照品(批号：111895-201805，含量以94.9%计)、黄芩素对照品(批号：111595-201808，含量以97.9%计)等，均购于中国食品药品检定研究院；色谱级乙腈、甲醇，美国DIKMA公司；水为超纯水。

保阴煎基准样品：取日剂量保阴煎处方饮片，按古籍记载方法制备煎液，煎液冷冻干燥，即得。保阴煎处方饮片所用药材分别采购自3产地，每个产地5批次，具体药材来源见表1。

2 实验方法与结果

2.1 指纹图谱研究

2.1.1 色谱条件

色谱柱为DIKMA Spursil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)- 0.1%磷酸水(B)，线性梯度洗脱程序：0～10 min，2%～10%乙腈；10～40 min，10%～14%乙腈；40～55 min，14%～18%乙腈；55～75 min，18%～30%乙腈；75～85 min，30%～60%乙腈；85～95 min，60%～90%乙腈；95～100 min，90%～95%乙腈。流速为1.0 mL/min，检测波长为230 nm，柱温为25 ℃，进样体积5 μL。

2.1.2 供试品溶液的制备

取基准样品约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇和无水乙醇(1∶1)混合溶剂20 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用溶剂补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 方法学考察

2.1.3.1 精密度试验

取基准样品，按2.1.2项下方法制备保阴煎供试品溶液，连续测定6次，采集指纹图谱，选择芍药苷作为参比峰，各峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均<3.0%，结果表明，该仪器的精密度良好，符合指纹图谱要求。

2.1.3.2 稳定性试验

取基准样品，按2.1.2项下方法制备保阴煎供试品溶液，分别于制备后0、3、6、9、12、18、24 h进样采集HPLC色谱图，选择芍药苷作为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积，计算RSD。指纹图谱共有峰在24 h内的相对保留时间RSD值<1.2%、相对峰面积RSD值<3.0 %，表明24 h内供试品溶液具备良好的稳定性。

2.1.3.3 重复性试验

取基准样品，按照2.1.2项下方法平行制备6份供试品溶液，测定HPLC色谱图，选择芍药苷作为参照峰，记录共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果指纹图谱中的相对保留时间RSD值均<1.0%，共有峰相对峰面积RSD值均<3.0%，说明该方法具备良好的重复性。

2.1.4 保阴煎指纹图谱的建立

2.1.4.1 指纹图谱相似度计算

取15批保阴煎基准样品，按照2.1.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下方法测定HPLC色谱图，见图1。将得到的各批次基准样品指纹图谱输入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)”，进行多点校正和匹配，得出保阴煎基准样品对照指纹图谱，见图2。确定20个共有峰并记录峰面积，计算相似度，结果见表2。15 批保阴煎基准样品指纹图谱与其生成的对照指纹图谱的相似度均>0.9，说明15批饮片制备的基准样品质量基本一致。为保障基准样品质量，暂定保阴煎基准样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度应>0.9。

表2 15批保阴煎基准样品指纹图谱的相似度评价结果

图1 15批保阴煎基准样品HPLC指纹图谱

图2 保阴煎基准样品HPLC对照指纹图谱

2.1.4.2 指纹图谱共有峰的归属

取保阴煎基准样品、各单味饮片及各缺味方饮片的水煎液冻干粉，按照2.1.2项下方法分别制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件采集HPLC色谱图，见图3。将保阴煎基准样品HPLC指纹图谱中各峰与饮片、缺味方的指纹图谱进行比对，确定保阴煎基准样品HPLC指纹图谱中各峰的归属。结果显示，在保阴煎基准样品 HPLC指纹图谱中1、6、8号峰来源于白芍，2号峰来源于生地黄和熟地黄，4、5、7、9、16号峰来源于黄柏，10、12、15、17、18、19、20号来源于黄芩，3、4、13、14号峰来源于续断，4、11、14号来源于甘草。

图3 保阴煎供试品溶液及各单味药材、缺味方供试品溶液的HPLC色谱图

2.1.4.3 指纹图谱共有峰的指认

制备中药化学对照品溶液，按照保阴煎基准样品指纹图谱测定方法测定HPLC色谱图，比较保留时间和紫外吸收光谱图，对保阴煎基准样品20个共有峰中的12个色谱峰进行了指认，其中1号色谱峰为没食子酸，2号色谱峰为5-羟甲基糠醛，4号色谱峰为绿原酸，5号色谱峰为黄柏碱，7号峰为木兰碱，8号色谱峰为芍药苷，11号色谱峰为甘草苷，15号色谱峰为黄芩苷，16号色谱峰为小檗碱，18号色谱峰为含汉黄芩苷，19号色谱峰为黄芩素，20号色谱峰为汉黄芩素，见图4。

注:1.没食子酸；2.5-羟甲基糠醛； 4.绿原酸；5.黄柏碱；7.木兰碱；8.芍药苷；11.甘草苷；15.黄芩苷；16.小檗碱；18.汉黄芩苷； 19.黄芩素； 20.汉黄芩素。图4 保阴煎基准样品HPLC指纹图谱共有峰的指认

2.2 含量测定研究

2.2.1 色谱条件

色谱柱为Waters Symmetry®C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸水，线性梯度洗脱程序：0～7 min，16%乙腈；7～8 min，16%～20%乙腈；8～10 min，20%～25%乙腈；10～20 min，25%～30%乙腈。芍药苷、小檗碱、黄芩苷及5-羟甲基糠醛的检测波长分别为231 nm、264 nm、277 nm、284 nm，柱温40 ℃，流速1.0 mL/min，进样体积10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备

取芍药苷、盐酸小檗碱、黄芩苷及5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL含0.90 mg、1.21 mg、1.03 mg、0.07 mg的对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，加甲醇定容，配制成浓度为每1 mL分别含芍药苷、盐酸小檗碱、黄芩苷和5-羟甲基糠醛46.99 μg、24.22 μg、171.20 μg、2.90 μg的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

称取保阴煎基准样品约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性溶液的制备

按照保阴煎基准样品的制备工艺分别制备缺地黄、缺黄柏、缺白芍、缺黄芩的保阴煎基准样品的阴性样品，再按2.2.3项下方法制备阴性样品溶液。

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 专属性试验

按照2.2.1项下色谱条件测定芍药苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、5-羟甲基糠醛对照品溶液、保阴煎基准样品供试品溶液和缺白芍、缺黄柏、缺黄芩及缺地黄的阴性样品溶液，所得HPLC色谱图见图5。结果显示阴性样品溶液在对照品峰相应位置处无干扰，各成分峰分离度良好。

注：a.对照品溶液；b.阴性对照溶液；c.保阴煎基准样品供试品溶液;1.芍药苷；2.盐酸小檗碱；3.黄芩苷；4.5-羟甲基糠醛。图5 保阴煎基准样品多成分含量测定专属性考察HPLC色谱图

2.2.5.2 线性关系

取2.2.2项下制备的芍药苷、盐酸小檗碱、黄芩苷和5-羟甲基糠醛对照品储备液，精密量取适量，加甲醇稀释制成每1 mL含芍药苷186.70 μg、盐酸小檗碱84.60 μg、黄芩苷632.40 μg、5-羟甲基糠醛10.97 μg的混合对照品溶液，再逐级稀释，共制得6个浓度的混合对照品溶液；取上述对照品溶液各10 μL，按照2.2.1项下的色谱条件测定其峰面积。以对照品溶液的浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，见表3。

表3 各成分的回归方程、相关系数、线性范围

芍药苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、5-羟甲基糠醛标准曲线的相关系数(r)均>0.999，分别在5.83～186.70 μg/mL、2.64～84.60 μg/mL、19.76～632.40 μg/mL、0.34～10.97 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

2.2.5.3 精密度试验

取保阴煎基准样品，按照2.2.3制成供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件连续测定6次，记录峰面积并计算相对标准差值。结果显示芍药苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、5-羟甲基糠醛峰面积的RSD值分别为1.18%、0.93%、0.93%、0.89%，表明仪器精密度良好。

2.2.5.4 重复性试验

取保阴煎基准样品，按照2.2.3项下制备方法制成6份供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件测定，记录峰面积并计算各成分含量及相对标准差值。结果显示芍药苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、5-羟甲基糠醛平均含量的RSD值分别为0.58%、0.20%、0.23%、0.77%，表明供试品溶液制备方法重复性良好。

2.2.5.5 稳定性试验

按照2.2.3项下方法制备保阴煎基准样品供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件，分别在制备后0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，计算芍药苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、5-羟甲基糠醛峰面积的RSD值分别为0.78%、0.42%、0.39%、1.40%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.5.6 加样回收率试验

取保阴煎基准样品9份，每份约0.05 g，精密称定，分别按已知含量的50%、100%、150%加入对照品5-羟甲基糠醛、芍药苷、盐酸小檗碱和黄芩苷，每个浓度设置3个平行样品，按照2.2.3项下制备方法制成供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件测定，计算各成分的加样回收率，结果显示芍药苷、小檗碱、黄芩苷及5-羟甲基糠醛的平均回收率范围分别为97.63%～102.03%、98.26%～101.60%、97.30%～101.60%、87.24%～90.39%，RSD值均<3%，符合《中国药典》要求。

2.2.6 保阴煎基准样品的含量测定

根据上述色谱条件及供试品溶液制备方法的考察结果，本研究建立的保阴煎基准样品中5-羟甲基糠醛、芍药苷、小檗碱、黄芩苷的同时含量测定方法可用于多批次保阴煎基准样品的含量测定。取15批保阴煎基准样品，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1项下色谱条件进样测定。记录样品中5-羟甲基糠醛、芍药苷、小檗碱和黄芩苷及其随行对照品的峰面积，按照外标一点法计算各成分含量，结果见表4。

表4 15批保阴煎基准样品中各成分的含量

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

由于甲醇具有较强的紫外末端吸收，作为流动相在梯度洗脱中出现了显著的基线漂移，故在保阴煎指纹图谱检测时选择紫外末端吸收较弱的乙腈作为流动相的有机相。保阴煎既含有黄芩苷等酸性成分，又含有小檗碱等碱性成分，色谱分离流动相中必须添加改性剂，故对乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.15%磷酸水的流动相组成系统进行考察。根据色谱峰的数目、峰型及分离度，可以明显看出流动相为乙腈-0.1%磷酸水时，峰型良好且分离度良好。在210～400 nm波长范围内采集HPLC色谱图，对比发现，检测波长为230 nm时，能获得最多的峰，各峰强度均适中。

在含量测定时，采集芍药苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、5-羟甲基糠醛在200～400 nm的紫外光谱图，观察各成分的紫外吸收特征，分别选择芍药苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、5-羟甲基糠醛在231 nm、264 nm、277 nm、284 nm的达峰波长为保阴煎中该成分的检测波长。分别考察甲醇-0.1%磷酸水和乙腈-0.1%磷酸水的洗脱系统，结果显示乙腈-0.1%磷酸水为流动相时分离度良好。进一步对柱温进行考察，发现柱温为40 ℃时各峰在其检测波长下均能达到基线分离，峰型较好，峰面积适中。

3.2 供试品溶液制备方法考察

本实验在建立指纹图谱及含量测定方法时均对取样量、提取时间及提取溶剂进行考察，优选供试品溶液制备方法。根据各成分的峰面积、峰型及分离度，最终选择1.0 g基准样品用甲醇-无水乙醇(1∶1)超声提取30 min制备指纹图谱供试品溶液，0.10 g基准样品用75%甲醇超声提取30 min制备含量测定供试品溶液，能够使各峰均能获得最优提取。

3.3 分析方法评价

本研究首先利用高效液相色谱法建立了保阴煎指纹图谱，确定了20个共有峰，包含了保阴煎组方药味白芍、续断、黄芩、黄柏、甘草的特征成分。该指纹图谱仅检测到来自生地黄和熟地黄的5-羟甲基糠醛，也没有发现山药的成分，主要是由于采用紫外检测器，一些紫外吸光系数较小的成分和含量相对很低的成分难以获得检测，例如地黄苷D、梓醇及山药甾体皂苷等成分[22-23]。对于此类成分，本研究通过薄层色谱法进行了定性鉴别。

保阴煎主治一切阴虚内热动血等证，现代文献报道多用于先兆性流产和功能性子宫出血的治疗[24-25]。本研究前期利用中医方证代谢组学方法，阐释了保阴煎治疗功能性子宫出血的生物效应，鉴定了63个原型入血成分和10个代谢产物，其中来自生地黄和熟地黄的5-羟甲基糠酸(原型成分为5-羟甲基糠醛)、来自白芍的芍药苷、来自黄芩的黄芩苷、来自黄柏的小檗碱，是与生物标志物高度相关的体内显效成分，可作为保阴煎关键质量标志物[13]。因此，本研究在指纹图谱分析基础上，进一步优化色谱条件和供试品溶液制备方法，建立了这4个关键质量标志物的同时含量测定方法。

4 结论

本研究建立了保阴煎基准样品HPLC指纹图谱检测方法，通过15批基准样品的测定，确定了对照指纹图谱及20个共有峰，暂定相似度大于0.9。选择药效相关、体现配伍的4个成分芍药苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、5-羟甲基糠醛，作为保阴煎基准样品质控成分，利用HPLC建立了同时含量测定方法。结合指纹图谱和多成分含量测定，为保阴煎基准样品的整体质量控制及其复方制剂的开发提供了方法。