2 种小檗属植物主要生物碱及总黄酮含量的比较

刘卫平，王 洋，赵志明，江 敏，冀 伟，李艳丽，张 军

（1.河北农业大学林学院，河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，河北 保定071000；2.石家庄市藁城区绿都市政园林工程有限公司，河北 石家庄 052160；3.河北省林业和草原调查规划设计院，河北 石家庄 050000）

小檗属植物习称“三棵针”，具有悠久的药用历史，民间常代以黄连使用[1]。小檗皮中含有的小檗碱、药根碱、掌叶防己碱等多种成分，具备抗菌、消炎、降血脂、抗血脂等功效[2-6]，有很高的药用价值。因此，大多数小檗属植物还是制药工业企业的原料。近年来，不断有学者从小檗属植物中提取到糖类、香豆素类、挥发油等其他类化合物[7-8]，拓宽了小檗属植物的药用范围。对小檗属植物的研究部位也由根、茎扩大到叶、枝，提高了资源的利用率。从环境保护、资源开发等方面考虑，若能合理利用小檗属植物的茎皮、果等地上部分，减少对地下部分的过度采伐，这对于改善生态环境、保护植被以及资源的持续利用具有重要意义。

冰川红叶小檗（Berberis thunbergii‘Bingchuanhong ye’）和紫叶小檗（Berberis thunbergii‘Atropurpurea’）均为小檗科小檗属落叶灌木。其中，冰川红叶小檗为小檗属新品种，是优良的园林色相树种，适宜在河北省石家庄市藁城区、张家口市康保县及其他生态条件类似地区栽培，在药用价值研究上笔者未见国内外文献报道；而紫叶小檗原产于东北南部至秦岭一带[9]，在我国各大城市均有栽培，主要作为一种独特的园林观赏植物，目前对其药用价值的研究主要集中在生物碱的测定[10]和果中小檗碱的测定[11]，对不同部位药根碱、掌叶防己碱、小檗碱和总黄酮随季节变化的规律还未见文献报道。为了合理利用小檗属药用植物资源，笔者建立了同时测定小檗属植物药根碱、掌叶防己碱和小檗碱含量的HPLC 方法，并采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色法测定其总黄酮含量，在此基础上对冰川红叶小檗和紫叶小檗这2 种小檗属植物不同部位生物碱和总黄酮含量随季节变化的规律进行比较，旨在为该类药材传统入药部位的科学评价以及药材的质量评价提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用植物材料为三年生的冰川红叶小檗和紫叶小檗，均采自河北省石家庄市藁城区南董镇南董村的绿都市政园林工程有限公司苗圃基地。该基地气候条件为暖温带大陆性季风气候，夏季高温多雨，冬季寒冷干燥，季风性显著，夏秋常受热带气旋影响，7、8 月降水居多）。基地中2 种小檗属植物均采取片植，株行距为30 cm×30 cm，常规管理，在生长季节不施追肥，干旱情况下浇水，将样地分为5 个小区，于2021 年5、8、10 月（即春季、夏季、秋季）各小区随机采集植株样品6 株，分别取根皮、茎皮、枝、枝梢、叶片为试验材料，将6 株同种植物同部位分别称取10 g 混合，自然阴干后60℃烘至恒重后粉碎过60 目筛，保存待测。药根碱、掌叶防己碱和小檗碱标准品来自北京索莱宝科技有限公司，芦丁标准品来自中国药品生物制品检定所。

1.2 试验方法

1.2.1 生物碱含量的测定（1）色谱条件。色谱柱为Welchrom C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈与0.02 mol/L 磷酸二氢钠的混合溶液（体积比24 ∶76），流速1.0 mL/min，检测波长345 nm，柱温40℃，进样量10 μL。（2）标准曲线的绘制。精密称取药根碱、掌叶防己碱和小檗碱标准品20 mg，先用适量甲醇溶液溶解，待完全溶解后定容至25 mL，摇匀，配置成浓度为0.8 mg/mL 的母液，精密吸取母液0.5、1、2、4、5、6、8 mL 加25 mL 甲醇制成 16、32、64、96、128、192、224 μg/mL 的混合标准品溶液，用带有0.45 μm 过滤膜的微孔针头取续滤液进样，精确吸取各浓度的标准样品各10 μL 注入液相色谱仪，分别以质量浓度x（药根碱x1、掌叶防己碱x2、小檗碱x3，单位μg/mL）为横坐标，峰面积y（药根碱y1、掌叶防己碱y2、小檗碱y3）为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数分别为：y1=48.39x1-421.17，R=0.992 2；y2=40.944x2-335.07，R=0.991 2；y3=45.283x3-447.68，R=0.991 1。3 种生物碱混合样品的色谱图如图1 所示。（3）待测样品溶液的制备。参照曾元儿[12]的“三颗针”盐酸小檗碱含量测定方法制备待测样品溶液。经方法学验证，待测样品的稳定性以及方法的精密度和重复性均符合检测要求。冰川红叶和紫叶小檗3 种生物碱的色谱图如图2 和图3 所示。

图3 紫叶小檗样品液在345 nm 处的HPLC 图谱

1.2.2 总黄酮含量的测定（1）标准曲线的绘制。采用李纯等[13]的方法略加修改，精密称取芦丁10 mg，加入适量80%甲醇溶液进行溶解，待完全溶解后定容至10 mL，摇匀，配置成浓度为1 mg/mL 的母液，取母液0.3 mL 加2.7 mL80%甲醇配制成100 μg/mL 的溶液，精密吸取溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL分别加80%甲醇0.9、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL 制成10、 20、40、60、80、100 μg/mL 的标准品溶液，加5%亚硝酸钠溶液30 μL，摇匀，放置6 min；添加10%硝酸铝溶液30 μL，摇匀，放置6 min；再加4%氢氧化钠溶液400 μL，放置5 min；用可见光分光光度计测定溶液在510 nm 处的吸光度，以吸光度为纵坐标、芦丁浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程y4=7.321 5x4-0.003 2，R2=0.999 9。（2）样品总黄酮含量的测定。精密称量0.05 g 小檗粉末，加入80%甲醇2 mL，于60℃下用40 kHz 超声波处理2 h，然后以1 000 r/min 的转速离心10 min，取上清540 μL，按标准曲线测定的方法，依次加入各试剂，测定510 nm 处的吸光值，根据标准曲线得出样品检测液总黄酮浓度，再换算成样品总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 2 种小檗属植物生物碱含量差异分析

2.1.1 2种小檗属植物药根碱含量差异分析 如图4 所示，2 种小檗属植物中药根碱含量在各部位的分布表现为根皮最高，其次为茎皮，叶片含量最少，枝与枝梢的差异不显著。从部位来看，紫叶小檗根皮、茎皮、枝、枝梢、叶片之间的药根碱含量比为7.40 ∶5.44 ∶2.25 ∶1.93 ∶1，根皮中含量为茎皮的1.36 倍；冰川红叶各部位之间的含量比为10.12 ∶4.90 ∶3.30 ∶3.12 ∶1，根皮中含量为茎皮的2.07倍。从品种来看，紫叶小檗的药根碱含量较高，除枝部含量品种间差异不显著外，其他部位的含量差异均达显著水平（P＜0.05），尤其是紫叶小檗的根皮、茎皮中药根碱的含量分别为冰川红叶相应部位的1.55和2.35 倍。从季节来看，根皮和茎皮中药根碱含量随春、夏、秋季推移呈逐渐上升的趋势；而枝、枝梢中的药根碱则均是夏季最多，春季最少；紫叶小檗叶片中药根碱含量随着季节变化逐渐积累，冰川红叶叶片仅在秋季出现药根碱成分。冰川红叶小檗根皮中秋季的药根碱含量分别比春、夏季显著增加34.2%、20.3%（P＜0.05）；茎皮中春—夏、夏—秋药根碱含量分别增加42.44%和23.32%（P＜0.05）；但枝、枝梢在春、秋2 季变化不大，而到了夏季略加增多。紫叶小檗根皮中的药根碱含量夏、秋季差异不显著，但夏季比春季显著增加了35.91%（P＜0.05）；茎皮中的药根碱含量随季节交替在春—夏增幅较低，但在夏—秋明显增加了40.83%（P＜0.05）；枝部药根碱含量在夏季显著升高，但到了秋季又显著降低，夏季含量为春季的1.39 倍（P＜0.05）；枝梢中药根碱含量变化规律与枝类似，夏秋2 季叶片中药根碱的含量变化不大，春季未出现该成分。

图4 2 种小檗属植物各部位的药根碱含量在不同季节的变化情况

2.1.2 2种小檗属植物掌叶防己碱含量差异分析 如图5 所示，紫叶小檗中掌叶防己碱含量以茎皮最高，冰川红叶则以根皮最高，2 种小檗属植物中掌叶防己碱含量在枝和枝梢的差异不显著，叶片中均未检测出该成分。从部位来看，冰川红叶小檗根皮、茎皮、枝、枝梢之间的掌叶防己碱含量比为3.88 ∶2.83 ∶2.51 ∶2.24，根皮中含量是茎皮的1.37 倍；紫叶小檗各部位之间的含量比为3.83 ∶3.97 ∶2.67 ∶2.56，茎皮中含量是根皮的1.04 倍。从品种来看，紫叶小檗的掌叶防己碱含量相对较高，但除了春季根皮含量和夏季枝梢含量品种间差异显著外，其他部位各季节的含量差异均不显著。从季节来看，2 种小檗属植物中各部位掌叶防己碱含量均表现为夏季最高，春季最低，枝梢含量随季节变化均不显著；冰川红叶小檗的茎皮和根皮中掌叶防己碱含量从春季到夏季分别显著增加了14.56%和18.23%（P＜0.05），枝中春—夏、春—秋掌叶防己碱含量分别增加了14.22%和10.78%（P＜0.05）；紫叶小檗根皮中春—夏、春—秋掌叶防己碱含量分别显著增加46.36%和34.11%（P＜0.05），夏季茎皮中掌叶防己碱含量是春季的1.43 倍，枝和枝梢春季到秋季掌叶防己碱含量变化不显著，仅分别增加了3.17%和4.94%，未达到显著水平。

图5 2 种小檗属植物各部位的掌叶防己碱含量在不同季节的变化情况

2.1.3 2种小檗属植物小檗碱含量差异分析 如图6所示，2 种小檗属植物各部位小檗碱成分主要集中在根皮和茎皮部位，枝和枝梢也有分布，叶片含量最低，冰川红叶小檗各部位含量差异明显，紫叶小檗各部位含量差异较小。从部位来看，紫叶小檗根皮、茎皮、枝、枝梢、叶片之间的小檗碱含量比为13.04 ∶11.66 ∶5.85 ∶6.10 ∶1，根皮是茎皮的1.12 倍；冰川红叶各部位之间的含量比为14.12 ∶6.00 ∶2.73 ∶2.83 ∶1，根皮是茎皮的2.35 倍，枝和枝梢中小檗碱含量相近。从品种来看，紫叶小檗的小檗碱含量较高，尤其是春季紫叶小檗根皮、茎皮中的小檗碱含量分别为冰川红叶相应部位的1.14 和3.16 倍，夏季枝梢中的小檗碱含量是冰川红叶小檗枝梢的2.80 倍，秋季枝部、叶部的小檗碱含量分别是冰川红叶小檗相应部位的2.26、1.18 倍，差异均达显著水平。从季节来看，冰川红叶小檗各部位小檗碱含量随季节推移而升高，紫叶小檗各部位小檗碱含量表现为夏季显著升高，秋季略有降低；冰川红叶小檗和紫叶小檗根皮、茎皮中夏季小檗碱含量升高均很明显，根皮分别升高了34.57%和39.86%，茎皮分别升高了120.26%和71.73%，均达到显著水平（P＜0.05）；冰川红叶小檗根皮、茎皮中的小檗碱秋季含量最高，分别是春季的1.56 和2.97 倍，而枝梢变化不显著；紫叶小檗根皮、茎皮中的小檗碱夏季含量最多，分别是春季的1.40 和1.72 倍，枝、枝梢增幅均较根皮、茎皮的低。

图6 2 种小檗属植物各部位的小檗碱含量在不同季节的变化情况

2.2 不同生物碱成分与品种、部位、季节逐步回归模型分析

为进一步探索不同生物碱成分与品种、部位、季节的关系，建立了不同生物碱成分与品种、部位、季节的逐步回归模型，以部位（A）、季节（B）、品种（C）为自变量，分别以药根碱（y1）、掌叶防己碱（y2）、小檗碱（y3）为因变量，进行逐步线性回归拟合。如表1 所示，影响药根碱和小檗碱含量的主要因素包括部位、季节、品种，影响掌叶防己碱含量的主要因素是部位，且均成正相关关系。逐步回归模型对药根碱、掌叶防己碱、小檗碱含量的平均精度分别为79.4%、77.5%、81.2%；其中，小檗碱预测精度最高，回归模型具有较强的代表性，可以利用此方程预测药材中的生物碱含量变化；药根碱和小檗碱与品种、部位、季节的逐步回归模型中，偏相关系数和直接通径系数由大至小均为A ＞C ＞B，掌叶防己碱与品种、部位、季节的逐步回归模型中，仅得到掌叶防己碱与部位回归模型（季节、品种回归方程均不显著）。这说明部位能准确预测不同生物碱含量的变化，其次是品种，季节的影响最小。

表1 生物碱成分与部位（A）、品种（B）、季节（C）的逐步回归模型

2.3 2 种小檗属植物总黄酮含量差异分析

如图7 所示，2 种小檗属植物总黄酮成分主要集中在叶片和枝梢，冰川红叶小檗根皮中总黄酮含量最低，紫叶小檗枝、根皮、茎皮中总黄酮含量差异不明显。从部位来看，冰川红叶小檗叶片、枝梢、枝、茎皮、根皮含量比为4.19 ∶2.88 ∶2.02 ∶1.41 ∶1，叶片是枝梢的1.45 倍；紫叶小檗各部位之间的含量比为3.16 ∶2.19 ∶1 ∶1.50 ∶1.40，叶片是枝梢的1.44 倍。从品种来看，冰川红叶小檗的总黄酮含量较高，除茎皮和根皮含量品种间差异不显著外，其他部位的含量差异均达显著水平（P＜0.05），尤其是冰川红叶小檗的叶片、枝梢中3 季总黄酮的平均含量分别为紫叶小檗相应部位的1.36 和1.35 倍。从季节来看，冰川红叶小檗除茎皮外其他部位的总黄酮含量均随着季节推移而升高，但枝、茎皮、根皮随季节变化差异不显著；紫叶小檗各部位的总黄酮含量随季节变化递增，除根皮差异不显著外，其他部位从春季到秋季含量变化差异显著（P＜0.05）；冰川红叶小檗叶片和枝梢春—秋的总黄酮含量分别增加38.18%和79.68%；紫叶小檗叶片和枝梢春—秋的总黄酮含量分别增加49.18%和62.40%，枝和茎皮春—秋的总黄酮含量分别增加28.43%和23.73%，均达到显著水平（P＜0.05）。

图7 2 种小檗属植物各部位的总黄酮含量在不同季节的变化情况

3 结论与讨论

3.1 结 论

试验结果表明，冰川红叶小檗和紫叶小檗的主要生物碱和总黄酮含量在不同部位和不同生长时期均有差异，总体趋势表现为：药根碱、掌叶防己碱和小檗碱3 种生物碱成分在根皮的含量最高，其中紫叶小檗含量高于冰川红叶小檗，紫叶小檗药根碱和小檗碱在根皮含量最高，掌叶防己碱在茎皮含量最高，而叶片含量均极低；总黄酮均以叶片中含量最高，其次为枝梢；掌叶防己碱各部位均为夏季含量最高；根皮和茎皮中药根碱均以秋季含量最高，枝和枝梢中药根碱均以夏季含量最高；冰川红叶小檗的小檗碱以秋季含量最高，紫叶小檗的小檗碱以夏季含量最高；春季3 种生物碱含量均较低；总黄酮均为秋季含量最高。因此，建议在小檗属植物生物碱资源开发利用时，原料采集以秋、夏季为主，冰川红叶小檗的利用以根为主，紫叶小檗以根和茎为主。同时，为了可持续发展和环境保护的需要，可加强对地上部位的开发利用。

3.2 讨 论

试验对2 个小檗品种3 种主要生物碱和总黄酮的含量进行了分析，结果发现，生物碱各含量一般表现为小檗碱＞药根碱＞掌叶防己碱，影响生物碱含量变化的影响因素表现为部位＞品种＞季节，部位对生物碱含量的影响最大。药根碱在各部位分布规律均表现为根皮＞茎皮＞枝＞枝梢＞叶片；掌叶防己碱含量在紫叶小檗各部位的分布规律表现为茎皮＞根皮＞枝＞枝梢＞叶片，在冰川红叶小檗各部位分布规律表现为根皮＞茎皮＞枝＞枝梢＞叶片；小檗碱各部位分布规律均表现为根皮＞茎皮＞枝梢＞枝＞叶片。这与向前胜等[14]对青海省3 种小檗根部、茎秆、枝梢部的研究结果以及高丽英等[15]对5 种小檗根皮、茎皮、根木、茎木、叶的研究结果相似。总黄酮在冰川红叶各部位分布规律表现为叶片＞枝梢＞枝＞茎皮＞根皮，在紫叶小檗各部位分布规律表现为叶片＞枝梢＞茎皮＞根皮＞枝，这与谢久祥等[16]对青海沙棘根、茎、叶片总黄酮含量的研究结果相似。

《中国药典（一部）》2010 年版附录记载了三颗针药材来源为小檗属数种植物的干燥根，采用HPLC测定小檗碱时其含量不得少于0.6%。该试验中冰川红叶小檗根皮中的小檗碱含量为1.4%～1.9%，夏秋季茎皮含量为0.8%～1.1%，紫叶小檗根皮和茎皮中的小檗碱含量分别为1.6%～2.3%和1.2%～2.1%，枝部和枝梢部的含量分别在0.75%～1.03%和0.79%～1.06%，均达到了《中国药典（一部）》2010 年版的要求。这不仅证实了根皮中小檗碱含量远大于茎皮，同时证实了冰川红叶小檗根皮和茎皮具有极高的药用价值，紫叶小檗除叶片外各部分均具有较高的药用价值。

生物碱大多为植物的次生代谢产物，在植物体内分布并不广泛，而是存在于一些特定的组织、器官或生育时期[17]，跟初生代谢一样，植物的次生代谢过程除受遗传基因的控制外，还受到非生物环境因子如土壤、光照、温度等因素的影响[18]。遗传物质感受环境信号并控制酶合成和产物生成是植物次生代谢产物与环境特殊相关性和对应性的内在机制，变化着的环境通过信使系统作用于核酸，核酸的适应表达控制次生代谢途径酶系统合成的种类和数量，最终影响次生代谢产物的形成[19]，根皮和茎皮生长不易受外界干扰，生长期相对较长，有利于生物碱和总黄酮的形成和积累，而当年生长的枝、枝梢、叶片，生长期较短，不利于其形成和积累，因而在各个器官含量分布产生差异，而总黄酮与生物碱变化规律不同，可能是与植物器官所承担的功能不同有关。

药材中有效成分的含量受物候期变化的影响[20]，采样时期不同也会造成次生代谢物含量的差异，根皮和茎皮中药根碱含量表现为秋季＞夏季＞春季，枝、枝梢中药根碱含量则表现为夏季＞秋季＞春季，紫叶小檗叶片中药根碱含量表现为秋季＞夏季＞春季，冰川红叶叶片仅在秋季出现该成分；掌叶防己碱含量在2 个品种中均表现为夏季＞秋季＞春季，叶片中均未出现该成分；冰川红叶各部位小檗碱含量表现为秋季＞夏季＞春季，紫叶小檗除叶片外其他部位的小檗碱含量表现为夏季＞秋季＞春季，在叶片中则表现为秋季＞夏季＞春季；2 个品种总黄酮含量均表现为秋季＞夏季＞春季。2 个品种生物碱和总黄酮含量均在春季含量较低，可能是各器官在初生生长为主的春季，光合同化产物主要供给植物生长发育需求，用于合成次生代谢物的底物较低，从而影响其合成与积累[21]；而夏季树木生长停滞，地下根、茎生物量和总黄酮含量逐渐增加，根部逐渐膨大，而且植物受环境影响易发生干旱胁迫，次生代谢产物的浓度也因此有所上升[17]；到了秋季，树木营养生长减缓，地上部分逐渐枯萎，而地下部分仍在不断生长，并且由于内源和外源因子的调节，次生代谢处于不活跃状态，在各器官中积累增多，从而使秋季次生代谢产物含量较高[22]；而夏季生物碱比秋季略高，可能是在适宜的干燥温度和水分条件下，营养物质发生水解，使其转化成为原形生物碱[23]，但由于产生这种差异的生物学机理尚不清楚，如生物转化、酶学机制、传输路径对生物碱和总黄酮的影响，目前还不能作出更为完整的生物学解释。

该研究测得的3 种生物碱和总黄酮在小檗属植物各部位的分布规律与前人的相关研究结论基本一致，但测得的3 种生物碱和总黄酮的绝对含量和季节变化规律与前人的相关研究结论有一定差异。这可能是由于产地不同且采样水平不同所致，而且同种植物个体间次生代谢产物的含量也具有一定差异性，随机取样很难控制样品的一致性；另外，样品采集后贮存方法和贮存时间也会对这些活性成分含量产生影响。