基于GAS、NO和MLCK信号通路观察一指禅推法干预脾虚家兔的作用机制

曾林琳，王继红，黄泽芳，贾文瀚

(广州中医药大学，广东 广州 510405)

一指禅推法是临床常见的推拿手法，该手法适应症广泛，可用于治疗胃脘痛、腹泻、便秘等消化系统疾病，如曹仁发教授在临床上运用一指禅推法治疗肠易激综合征[1]。在前期实验中，闫冬等[2]研究不同频率段一指禅推法对脾虚家兔胃肠黏膜形态学影响的实验中得出，101～150次/min频率段的一指禅推法干预后的脾虚家兔的胃肠黏膜最接近健康组家兔，因此本次实验选取101～150次/min频率段作为一指禅推法的频率。另外，基于前期研究基础，本实验继续采用MFF多点薄膜压力传感器测试手法压力，该设备可以实时测试手法的压力变化，根据多人多次进行的手法模拟操作，经过反复测定和观察评估，最终选定以150 mN作为该手法统一的压力值。由于人工智能机械臂可通过相应软件量化各项操作数据，故本次实验将采用人工智能机械臂模拟操作一指禅推法。功能性消化不良是临床上发病率较高的消化系统疾病，其病因为胃肠激素分泌异常，影响胃肠平滑肌收缩舒张，导致胃肠功能减退[3]。现代药理研究表明，在胃肠道平滑肌细胞内的肌球蛋白轻链激酶(MLCK)通路可控制胃肠平滑肌的收缩舒张[4]，而石玉生等[5]通过以和解肝脾腹部推拿法干预非酒精性脂肪肝大鼠，发现腹部推拿法可通过调控肠组织MLCK信号通路,从而改善肠上皮屏障功能。综上，本实验研究中以脾虚型家兔为研究对象，选择胃泌素(GAS)及一氧化氮(NO)为主要研究指标，探究抑制MLCK通路的情况下，一指禅推法能否影响脾虚型家兔的胃肠激素的分泌，如能影响，则可说明一指禅推法可通过其他通路或途径对脾虚型家兔的GAS及NO产生作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物及其分组

选取普通成年新西兰兔40只，体质量为(2.0±0.5)kg，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(粤)219-0035，分笼饲养并于兔笼外贴标签编为1～40号，其中1～20号置雌兔，21～40号置雄兔。在室温24 ℃环境中，分笼适应性喂养7 d。待其进食，活动和粪便正常开始分组，具体为：每次分组在1～20号、21～40号各随机取5只家兔组成1组，每组10只，共分为4组，分别为空白组(K组)、模型组(P组)、一指禅推法治疗组(A组)、抑制剂组(I组，采用A组治疗方法+腹腔注射ML-9)。

1.2 造模药物的制备及造模过程

本实验采用灌饲小承气汤和饥饱失常法建立脾虚证家兔模型[2]，除K组外，P组、A组、I组均进行造模处理。本造模方法是将大黄36 g，厚朴27 g，枳实18 g混合(全部饮片均为袋装可溶制剂，由广州致信药业有限公司提供)，加入650 mL蒸馏水浸泡30 min，将蒸馏水连同生药一起倒入1000 mL烧瓶中，将烧瓶放在电热套上，至药汁沸腾45 min。倒出药汁，在12层纱布上过滤2次，过滤后的药汁倒入旋转蒸发仪的烧瓶中，以70 ℃的温度将药汁浓缩至80 mL，即浓度为1 g/mL，按生药6 g/kg体质量给药。隔日灌胃1次，每次喂饲常规量饲料的一半，自由饮水，造模同时记录家兔行为学改变。连续15 d可造成脾虚证功能性消化不良动物模型。

分别于造模前、后进行评估，记录各组家兔症状变化，包括体质量、食量、大便次数及行为学改变等，记录于“家兔行为学量表”上，用于综合评价造模成功与否。造模组家兔体质量减轻、食量下降、大便次数增多及行为学差异，则可判断造模成功。

1.3 主要实验仪器、试剂及相关参数校对

1.3.1 实验仪器

TEKSCAN压力测试调制器、校对器、动态数据采集器及MFF多点薄膜压力传感器由上海邑成测试设备有限公司生产；智能机械臂(越疆科技，DOBOT魔术师)；家兔固定器(上海化科实验器材，PVC-01)；计时器(拜杰有限公司，cp-167)。

1.3.2 实验试剂

ML-9试剂,是Akt激酶的选择性强效抑制剂，可有效抑制MLCK活性，由生物制剂(北京)生物技术有限公司提供，批号：YZM002844。

1.3.3 相关参数校对

连接好相关器械后，将人工智能机械臂置于家兔腹部操作手法，并控制频率处于101～150 次/min频率段，施加同等力量值操作并保持1 min，在电脑上建立力-电压之间的拟合函数模型y=a+bx，然后通过校对器得出曲线的标准力量值和频率值，此后操作频率都必须落在该组要求的频率范围内。手法操作时，压力值采集选用MFF多点薄膜压力测试系统，手法压力值以观察实时采集数据为度量标准，具体操作过程：共选取5名测试者各测试10次，选取其中手法压力曲线均值较接近的5组为样本并取其平均值；再取其平均值作为手法治疗的标准操作值。手法操作时，全部治疗组手法压力均值控制在以上标准操作值不超过±5%[2]。经过上述模拟测试后，选取150 mN的压力值作为该手法的压力。

1.4 干预方法

1.4.1 穴位定位

采用比较解剖学和模拟人体经穴定位法结合进行新西兰兔穴位定位[6]。中脘穴：取家兔胸骨下端和肚脐之间连线的中点；天枢穴：取肚脐与腹外侧之间连线上内1/3与外2/3的交点。

1.4.2 手法操作

(1)由两名助手将家兔固定于手术台上，腹部向上，剃毛后定好穴位。(2)电脑进入压力监测界面，且设定机械臂操作频率为101～150次/min。(3)在家兔腹部固定好压力传感器。(4)使用人工智能机械臂于中脘、天枢(双)行一指禅推法，操作时观察电脑显示的压力曲线变化以保证手法力量与波形稳定，操作后保存压力曲线记录。每穴推5 min，每次治疗时长为15 min，每天1次，连续10 d。其中I组家兔在每日治疗结束后注射ML-9(2 mg/kg)，抑制MLCK靶点，持续干预10 d。

1.5 血清胃泌素(GAS)水平测定

胃泌素采用家兔血清样本提取。血清样本处理如下：采血得到血液后静置使其自然凝固，在4 ℃下，3 000 r/min离心20 min，收集上清液即为待测血清。GAS水平测定采用ELISA法，具体步骤严格按试剂盒说明书进行操作。

1.6 胃窦一氧化氮(NO)水平测定

将胃内容物充分清洗干净之后，自家兔胃幽门括约肌处取得适量胃窦部组织，并用蒸馏水冲洗干净后用滤纸吸干多余水分，称重，按1∶9(质量/体积)的比例，加入PBS，冰水浴条件下破碎组织得到匀浆液，4 000 r/min离心15 min，取上清液。蛋白浓度测定采用考马斯亮蓝法，以硝酸还原酶法测定组织匀浆上清液的NO水平，实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组家兔GAS水平对比

结果显示，4组GAS水平结果均为正态分布，故采用对比均数进行分析。组间两两比较，除A组(20.66±1.71)和I组(19.96±4.40)比较差异无统计学意义(P>0.05)，其余组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)；与K组(7.17±3.89)比较，P组、A组、I组的GAS平均水平处于较高水平，其中P组(78.82±8.32)GAS平均水平最高，而A组和I组均为接受治疗后的组别，两组的GAS水平较K组上升，较P组下降，而A、I两组之间无显著性差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组家兔GAS水平比较

2.2 各组家兔NO水平对比

结果显示，4组NO水平结果均为正态分布，故采用对比均数进行分析。组间两两比较，除A组(46.64±5.10)和I组(4.03±1.27)比较差异无统计学意义(P>0.05)，其余组间比较，均有显著性差异(P<0.05)；与K组(46.64±5.10)比较，P组、A组、I组的NO水平处于较低水平，其中P组(4.03±1.27)水平最低，A组及I组的NO水平较K组下降，较P组上升，而A、I两组之间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组家兔NO水平比较

2.3 治疗前后家兔食量对比

选取治疗前一天的家兔进食量与结束治疗后一天的家兔进食量进行对比，验证治疗是否有效。治疗前一天各组的进食量为正态分布，故采用对比均数进行比较；治疗结束后一天，各组的进食量为正态分布，故采用对比均数进行比较。进行组内治疗前后的进食量比较，K组及P组治疗前后进食量差异无统计学意义(P>0.05)，A组及I组两组治疗后的进食量均比治疗前进食量增加，且治疗前后进食量有显著性差异(P<0.05)，而A组及I组两组进食量在治疗前后差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 各组家兔治疗前后平均进食量对比

3 讨论

GAS及NO对胃肠运动功能皆有不同方面的影响，分析治疗后胃肠激素水平，通过对比各组胃肠激素水平及各组治疗后进食量，明确一指禅手法治疗脾虚证家兔模型的疗效。

3.1 治疗后GAS水平分析

GAS由胃窦部G细胞分泌，该激素水平变化与胃肠运动功能有密切的关系，能够引起胃窦收缩和胃底舒张，延迟胃排空[7]。GAS对胃运动产生影响的可能机理如下：(1)GAS可与幽门上的受体相结合，经过相关生化反应激动两个信号传递途径：IP3/Ca2+和DG/PKC途径[8]，继而使幽门收缩。(2)GAS可间接通过内脏神经或迷走神经反射抑制胃排空[9]。由此证明，胃泌素具有减缓胃排空的作用。GAS可影响模型组家兔的胃运动功能，延长胃排空时间。造模后，P、A、I组GAS水平较K组升高，表示造模成功，经手法治疗后的A组及I组GAS水平较P组都有下降，说明一指禅手法可减缓脾虚型家兔的胃窦收缩和胃底舒张，加强胃排空，进而促进家兔的胃运动功能。

3.2 治疗后NO水平分析

NO是一种重要的脑肠肽，可调节平滑肌舒张性，具有抑制胃肠收缩功能的作用，亦对内脏感觉的传导有抑制作用，在中枢及外周神经调节胃运动过程中扮演重要角色。因此当NO含量升高时，可减少降低内脏敏感性，对腹痛等症状有改善作用[10]。本实验中，K组NO水平最高，P组NO水平最低，而经手法治疗后的A组及I组的脾虚型家兔，其NO水平较P组都有上升，结合治疗后脾虚型家兔进食量的上升，说明一指禅手法可调控NO含量，推测其可降低脾虚型家兔腹痛等不适症状，使治疗后的脾虚型家兔进食量增加，促进胃肠摄入功能的恢复。

3.3 关于MLCK通路的讨论

现代生理研究认为，在胃肠道平滑肌细胞内有两条信号通路可控制消化道的收缩舒张运动功能，包括肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和蛋白激酶C(PKC)两条途径，而MLCK通路的作用更为突出，常与钙离子浓度相关。本实验A组及I组均为一指禅手法治疗组，而I组注射了ML-9(MLCK抑制剂)。实验结果提示，A组及I组两组的胃泌素及NO水平比较差异皆无明显统计学意义，即不能证明一指禅手法治疗对MLCK具有影响性。目前研究认为胃肠道平滑肌细胞内具有不同的通路，MLCK通路仅为其中一条。据现代生理学研究表明，GAS可通过IP3/Ca2+和DG/PKC通路影响胞内钙离子浓度[8]，从而影响胃肠运动功能，因此抑制MLCK通路并未影响一指禅手法通过其他通路影响相关胃肠激素，如NO及GAS，从而对胃肠平滑肌的收缩舒张产生作用。

4 小结

在本实验中，治疗后脾虚型家兔的相关胃肠激素含量较治疗前有所变化，但仍未恢复至正常家兔的水平，说明一指禅推法治疗后，家兔受损的胃肠功能可得到一定程度的恢复。此外，通过实验结果可得知，尽管现有药理学研究证据表示MLCK通路途径为主导，但本实验暂未发现一指禅推法与MLCK通路存在对应关系。由于消化道平滑肌内存在多条通路，如张锋利等[11]研究表明桔梗枳壳汤加味可通过抑制PI3K/Akt通路调节胃肠激素，增强胃肠动力。这也说明一指禅治疗手法亦可作用于其他通路(如IP3/Ca2+和DG/PKC)，使胃肠运动的相关激素如GAS的水平产生变化；NO亦属于常见的神经递质，与GAS一样亦可通过神经—体液系统使胃肠道平滑肌进行收缩舒张运动。骆雄飞等[12]通过腹部推拿干预便秘型肠易激综合征家兔，探讨推拿手法对ENS-ICC-SMC网络神经递质的作用，发现推拿力可转化成机械波影响肠道神经元。结合本次实验结果，亦可说明一指禅推法可能通过神经-体液系统对胃肠功能产生影响，最终对脾虚型家兔起到治疗作用，有待下一步实验探究。综上可得出，一指禅推法可通过多通路、多途径影响脾虚型家兔的胃肠运功，并促使其胃肠功能趋于正常。