升阳益胃汤对腹泻型肠易激综合征大鼠结肠及下丘脑组织5-HT含量的影响

毕珺辉，杨悦，杨育同，陈宜瑶，舒晓葳，冯玉华*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.山西中医药大学，山西 晋中 030000)

肠易激综合征(Diarrhea Irritable Bowel Syndrome，IBS-D)是一种功能性胃肠道疾病，其症状是反复腹痛并伴有大便性状及排便频率的改变，肠易激综合征的病因尚未明确，但“脑-肠轴”功能紊乱会导致内脏高敏反应、中枢神经系统失调，这可能是导致肠易激综合征的原因之一[1]。脑肠肽是一种在脑和胃肠道中双重分布的肽类，是连接中枢神经系统和胃肠道的桥梁，也是“脑-肠轴”信号传导功能实现的重要基础。5-羟色胺是脑肠肽中一种重要的神经递质，其含量变化与肠易激综合征的发生发展密切相关。中医学认为脾失健运，运化失司，水液输布不畅则易产生湿浊痰瘀；水谷精微运化不及则有食积，气机不畅，则会导致肠道功能紊乱。升阳益胃汤来源于李杲之《内外伤辨惑论》，乃补中益气汤以白芍易当归、防风易升麻，再加茯苓、半夏、羌活、独活、泽泻、黄连而成，较之补中益气汤在补气升阳之中又增除湿清热之效，故宜于脾胃虚弱，清阳不升，湿郁生热之证。本实验通过构建腹泻型肠易激综合征大鼠模型，观察各组大鼠结肠及下丘脑组织中5-HT的含量变化，探讨升阳益胃汤对IBS-D大鼠5-HT含量的影响，从而为升阳益胃汤之药物运用提供一定的实验依据。

1 主要材料及仪器

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠60只，体质量(200±20)g，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(黑)2018-003，给予充足饮食及饮水，在标准实验条件下饲养，适应性喂养1周后开始实验。

1.2 药物与试剂

升阳益胃汤中药饮片(黄芪、半夏、人参、甘草、独活、防风、白芍、羌活、橘皮、茯苓、柴胡、泽泻、白术、黄连)及番泻叶购于北京同仁堂;匹维溴铵(批号：713056，规格50 mg/片，MYLAN LABORATORIES SAS)；RAT 5-HT ELISA KIT 96Tests酶联免疫试剂盒(Biotopped Cat No.EL02905 Lot:2021/08);无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司);二甲苯(国药集团化学试剂有限公司);HE染液套装(Servicebio);中性树胶(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 主要仪器

洗板机(芬兰Thermo Labsystems，仪器型号：AC8);酶标仪(芬兰Labsystems Multiskan MS，仪器型号：352型);离心机(微量高速离心机，仪器型号：TG16W);培养箱(隔水式恒温培养箱，仪器型号：GNP-9080型);脱水机(DIAPATH);包埋机(武汉俊杰电子有限公司);病理切片机(上海徕卡仪器有限公司);冻台(武汉俊杰电子有限公司);组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司);染色机(DIAPATH);烤箱(天津市莱玻瑞仪器设备有限公司);载玻片(Servicebio);正置光学显微镜(日本尼康)、成像系统(日本尼康)。

2 方法

2.1 药物制备

2.1.1 升阳益胃汤中药饮片制备

升阳益胃汤中药饮片依照原方用法用量磨成粗粉，加8倍水，将药物用纱布包裹煎煮30 min后过滤药液，浓缩成1.35 g/kg、2.7 g/kg、5.4 g/kg的药液，于4 ℃冰箱中存放备用[2]。

2.1.2 匹维溴铵阳性对照药制备

将匹维溴铵片碾碎，加蒸馏水配制成0.018 g/kg的药液，放入4 ℃冰箱中备用。

2.1.3 番泻叶的制备

番泻叶粗粉中加入8倍100 ℃水浸泡30 min，滤出药液，利用旋转蒸发仪将其浓缩至0.45 g/mL[3-4]。

2.2 IBS-D动物模型复制

每日9∶00 am，除空白组外，其余大鼠均用0.45 g/mL浓度的番泻叶浸出液进行灌胃给药，灌胃量为10 mL/kg，灌胃1 h后，使用6.5 cm宽的医用胶带自大鼠前胸起缠绕一周以固定其前爪及项后背部，从而束缚大鼠，使大鼠前肢不能随意活动，抓挠面部，但不妨碍大鼠正常走动，在大鼠束缚过程中，保证其始终处于束缚状态，若挣脱束缚，则立即重新用医用胶带固定，束缚时间持续1 h，束缚的同时使用夹尾夹夹尾刺激，刺激持续15 min，刺激结束后，将各组大鼠分别放回鼠笼，保证饮水及食物充足，造模持续2周，造模过程中对大鼠一般情况进行观察[5-6]。

2.3 实验动物分组及给药

造模成功后，将模型组大鼠按照随机数字表法[7-8]分为模型组、升阳益胃汤高剂量组、升阳益胃汤中剂量组、升阳益胃汤低剂量组、阳性药对照组，另设空白组，每组10只。造模结束后于每日固定时间进行灌胃给药，连续给药2周，模型组及空白组给予等体积的生理盐水。

2.4 样本采集

样本采集前禁食不禁水18 h，末次给药后1 h用水合氯醛麻醉大鼠，选取大鼠远端结肠约2 cm，将其一分为二，一份置于液氮中保存，另一份于4%多聚甲醛中存储。断头取脑，在冰盘上剥离出下丘脑，放入液氮中暂存。液氮中的组织随后转入-80 ℃冰箱保存。

2.5 大鼠一般情况观察

实验开始后观测大鼠精神状态，皮毛颜色、进食饮水、排便等一般情况，并于造模前、给药前、给药后测量大鼠体质量。

2.6 腹壁撤退反射

参照AWR评分标准，给药结束后对大鼠进行内脏敏感性评价。测量腹壁撤退反射前18 h禁食不禁水，用大小合适的透明容器限制大鼠运动。

(1)准备血压计、5 mL注射器，将注射器与血压计连接，用注射器向血压计内注气，记下80 mmHg、60 mmHg、40 mmHg、20 mmHg不同压力下注射器对应刻度。

(2)将注射器与儿童用8F导尿管相连，导尿管中用注射器注气，达到相应刻度时，压强为导尿管前端球囊内的压力。

(3)导尿管涂上石蜡油以保持润滑，从大鼠肛门插入约6 cm，在大鼠肛门外1 cm处，将导尿管与大鼠尾根部用医用胶带固定在一起。然后将大鼠放在透明容器中，待其保持平静状态一段时间后，用注射器向导尿管内充气，随着压力的不断增强，观察每只大鼠的腹壁对8F导尿管前端气囊扩张刺激的反应程度。

每只大鼠测3次，每次间隔5 min[9]。评分标准为大鼠在不同压力刺激下的反应程度：0分，对刺激无明显行为反应；1分，身体保持不动，但头部出现短暂运动；2分，腹部肌肉未离底面，但呈收缩状态；3分，腹部肌肉抬离底面，腹肌收缩；4分，身体呈弓形状态，骨盆抬起[3]。

2.7 ELISA法测定大鼠结肠、下丘脑中5-HT含量

于-80 ℃冰箱中将组织取出，室温下解冻，用PBS冲洗干净后，用滤纸吸干多余液体，将组织剪碎，在冰浴条件下，用匀浆机将组织进一步粉碎，匀浆液离心取上清液，按照ELISA试剂盒说明测定大鼠结肠、下丘脑中5-HT的含量。

2.8 HE染色观察大鼠结肠组织病理学

结肠组织经4%多聚甲醛固定，固定状态良好后，严格按照程序进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片、镜检。在显微镜下浏览切片，在不同倍数下详细观察组织切片情况，对切片中基本病理改变如充血、瘀血、出血、水肿、变性、坏死、增生、纤维化、机化、肉芽组织、炎性变化等情况进行观察。

2.9 统计学处理

3 结果

3.1 升阳益胃汤对IBS-D大鼠体质量的影响

空白组大鼠在实验过程中，精神状态良好，皮毛光泽顺滑，进食饮水均保持正常水平。模型组大鼠在造模期间表现出攻击性，反抗强烈，造模后精神状况较差，对刺激敏感，经常蜷缩抱团，进食、饮水与空白组相比有所减少。造模前，两组大鼠体质量相差不大，差异无统计学意义。造模后，模型组大鼠体质量增长缓慢，与空白组大鼠比较，差异具有统计学意义。造模前后各组大鼠体质量变化见表1。

表1 造模前后各组大鼠体质量变化

药物干预前，各组大鼠体质量与空白组比较均有统计学意义；药物干预后，阳性药组及升阳益胃汤各剂量组大鼠精神状态转好，进食、饮水情况较药物干预前有所好转，模型组大鼠体质量与空白组比较，差异具有统计学意义，阳性药及升阳益胃汤各剂量组与模型组比较体质量增长较快，但差异不具有统计学意义，见表2。

表2 药物干预前后各组大鼠体质量变化

3.2 腹壁撤退反射情况

药物干预结束后，与模型组相比，升阳益胃汤高、中、低剂量组及阳性药对照组在不同压力下的腹壁撤退反射评分均有所下降。在20 mmHg压力下，各给药组腹壁撤退反射评分低于模型组，差异不具有统计学意义(P=0.094>0.05)；球囊压力在40 mmHg时，升阳益胃汤低剂量组的腹壁撤退反射评分低于模型组，但差异不具有统计学意义(P=0.053>0.05)。除此之外，在40 mmHg、60 mmHg、80 mmHg压力下，各给药组的腹壁撤退反射评分均低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示各给药组能够有效减轻IBS-D大鼠的内脏高敏情况，见表3。

表3 药物干预后各组大鼠AWR评分变化分)

3.3 升阳益胃汤对IBS-D大鼠结肠及下丘脑5-HT的影响

模型组大鼠结肠及下丘脑组织中5-HT含量与空白组比较显著升高(P<0.05)。各给药组大鼠结肠及下丘脑组织中5-HT含量与模型组比较显著降低(P<0.05)，见表4。

表4 升阳益胃汤对IBS-D大鼠结肠及下丘脑5-HT含量的影响

3.4 升阳益胃汤对IBS-D大鼠结肠组织病理学的影响

空白组大鼠结肠黏膜结构完整，各层组织结构分明，上皮细胞无明显变化，无异常病理学改变；模型组固有层腺体数量丰富，排列紧密，间质可见较多淋巴细胞浸润，无其他病理学改变；阳性对照组黏膜上皮完整，未见明显的上皮细胞变性、坏死和脱落，间质可见较多的淋巴细胞，部分淋巴管充满淋巴细胞，黏膜下层和肌层未见明显异常。升阳益胃汤低剂量组未见明显的上皮细胞变性、坏死和脱落，底部杯状细胞含量丰富，间质可见少量的淋巴细胞；升阳益胃汤中剂量组固有层腺体数量丰富，排列紧密，间质可见少量淋巴细胞，无其他病理学改变；升阳益胃汤高剂量组无异常病理学改变；固有层腺体数量丰富，排列紧密，间质可见少量的淋巴细胞；各组大鼠结肠黏膜下层和肌层均未见明显异常，无病理学改变，符合腹泻型肠易激综合征病理特点，见图1。

注：A1、A2空白组；B1、B2模型组；C1、C2升阳益胃汤低剂量组；D1、D2升阳益胃汤中剂量组； E1、E2升阳益胃汤高剂量组；F1、F2阳性对照组。图1 各组大鼠对腹泻型肠易激综合征大鼠结肠组织病理学影响

4 讨论

肠易激综合征是一种慢性功能性胃肠道疾病，其特征是腹痛、排便习惯改变、腹泻或便秘，但在显微镜观察下无器质性病变，虽然IBS为非致命性疾病，但由于其具有难治愈、易复发的特点，IBS仍然给患者日常生活带来巨大影响。有研究指出，患有肠易激综合征的人群会严重影响生活质量，降低工作效率，更容易产生疲劳感[11-12]。IBS的病因还未明确，但肠-脑互动异常、内脏高敏感性、胃肠道动力异常、肠道低度炎症等是其可能的发病机制[10]。现代研究认为[13]，“脑-肠轴”间的双向信号传导失调是致病机制之一。“脑-肠轴”双向信号传导失调，由神经内分泌和免疫因素介导，并由心理社会因素调节，共同成为了IBS发生发展的重要因素。“脑-肠轴”的信号传导离不开脑肠肽，脑肠肽是一类小分子的肽类物质，同时分布于中枢神经系统及胃肠神经系统，由于脑肠肽双重分布的特性，脑-肠之间实现了中枢神经系统和胃肠效应细胞之间的信号传导。5-HT广泛分布于胃肠道和中枢神经系统，在外周神经系统和肠神经系统中作为神经递质发挥重要作用。5-HT系统功能障碍会导致胃肠动力异常及内脏敏感性增加，5-HT浓度升高时会增加肠道蠕动频率和内脏敏感性[14-15]。

中医认为IBS的发病与情志失调、饮食不节、感受外邪密切相关，病位在肠，与肝、脾(胃)等脏腑相关。脾主运化水湿，脾虚纳运乏力，水液输布不畅则会产生湿浊痰瘀；水谷精微运化不及，则饮食不化而形成食积；气机不畅则致肠道功能紊乱；肝失疏泄，横逆犯脾，脾气不升则有泄泻；腑气通降不利则有腹痛、腹胀。

升阳益胃汤来源于李杲之《内外伤辨惑论》，乃补中益气汤以白芍易当归、防风易升麻，再加茯苓、半夏、羌活、独活、泽泻、黄连而成。加茯苓、泽泻、半夏，以助除湿和胃之效；加羌活、独活，可祛浸淫肌肉筋骨之湿；加黄连，能清中焦之湿热；用白芍，以其既有当归养血之能，又因酸收而可防诸辛散药耗气之虞；用防风，取其既有升麻升发脾气之功，又兼祛风胜湿之用，较之补中益气汤在补气升阳之中又增除湿清热之效，故宜于脾胃虚弱，清阳不升，湿郁生热之证。

实验结果表明升阳益胃汤各剂量组均可提高IBS-D大鼠体质量，改善腹泻症状，降低内脏敏感性，保护IBS-D大鼠结肠黏膜形态，降低IBS-D大鼠结肠及下丘脑组织中5-HT的含量，其作用呈剂量依赖性。其中，升阳益胃汤高剂量组效果优于各给药组，其作用机制可能是通过降低结肠及下丘脑组织中5-HT的含量从而改善脑肠肽的异常分泌，使“脑-肠轴”信号传导功能恢复正常、内脏敏感性降低而实现的。但5-HT是独自发挥作用还是与其他胺类介质如肾上腺素、多巴胺发生拮抗或激动作用仍需进一步研究。