加味柴芍六君汤减轻炎症反应在缺氧诱导的慢性萎缩性胃炎胃黏膜损伤中的保护作用研究

洪银洁，涂文玲，傅颐，陈静怡，朱景茹，甘慧娟，李旻

(福建中医药大学，福建 福州 350122)

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是以固有层腺体萎缩为主要病理特点的消化系统常见病，是“炎癌转化”的关键环节。中医学依据症候表现将其归属于“胃痛”“胃痞”“嘈杂”等，CAG病机以本虚标实为根本，脾胃虚弱为本，胃络瘀血为标，瘀血亦是CAG发生发展的重要因素[1]。IL-1β、IL-6属于促炎细胞因子[2]，与CAG的“炎癌转化”进展密切相关，在检测炎症和评估CAG病情进展方面具有重要参考价值。HIF-1α表达水平与细胞缺氧程度呈正相关[3]，CAG病久入络，胃络血运不畅，瘀血内阻，形成炎症局部缺氧环境。加味柴芍六君汤在疏肝理气、健脾和胃基础上，加入丹参、莪术两味中药，兼顾活血祛瘀之效，能显著改善临床症状并促进炎症修复[4-6]，然而其逆转CAG胃黏膜病理改变的分子机制尚未完全阐明。本研究应用加味柴芍六君汤治疗CAG模型大鼠，通过HIF-1α表达变化以及IL-1β、IL-6含量来探讨加味柴芍六君汤逆转慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜病理改变的炎症相关生物学机制，可以进一步明确疏肝健脾化瘀治疗CAG的效果，为相关研究提供参考。

1 材料

1.1 动物

20只SPF级SD大鼠，雄性，体质量100～120 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2019-0005，饲养于福建中医药大学SPF级动物实验中心，屏障环境下，控制环境温度21～24 ℃，空气湿度50%～60%。动物实验过程符合《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定，并取得福建中医药大学伦理委员会批准。

1.2 药物

加味柴芍六君汤组成包含柴胡6 g，白芍4.5 g，人参9 g，白术9 g，茯苓9 g，半夏4.5 g，陈皮3 g，炙甘草6 g，丹参9 g，莪术9 g，中药饮片均购于福建中医药大学附属第三人民医院药剂科。浸泡30 min后单蒸水煎煮2次，混合后浓缩至含生药量0.69 g/mL的中药煎液，经洁净纱布过滤后分装，4 ℃保存备用。

1.3 试剂

脱氧胆酸钠，批号20201209，北京奥博星生物技术有限公司；25%～28%氨水，批号202008011，西陇科学股份有限公司；HE染色试剂盒，批号J21D10Y106492，上海源叶生物科技有限公司；大鼠白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6) ELISA试剂盒，批号LOT20210510A，上海酶联生物科技有限公司；RNA提取试剂盒，批号R401-01，Vazyme；逆转录试剂，批号AKF1919A，宝生物工程(大连)有限公司；PCR试剂，批号AK41790A，宝生物工程(大连)有限公司。

1.4 仪器

RM2245型半自动轮转式切片机(德国Leica公司)；5424R型高速冷冻离心机(德国Eppenddorf公司)；TissueLyser Ⅱ型组织研磨仪(Giagen公司)；RT6100型酶标仪(Rayto公司)；Nanodrop 2000型紫外-可见分光光度计(美国Thermo Scientific)；QuantStudio6 Flex型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

2 方法

2.1 动物分组及造模

将大鼠适应性喂养1周后按随机数字表法分为正常组6只，造模组14只。造模方法参照文献[7]加以改进，将脱氧胆酸钠粉末溶于单蒸水中配成8.29 g/L的脱氧胆酸钠溶液，将氨水溶于单蒸水中配制成3.78 mL/L的氨水溶液，用以造模组大鼠每日交替饮用，并配合饥饱失常(两日饱食，一日停食)，循环往复，共16周。造模结束后随机取2只造模组大鼠取材观察胃黏膜组织病理形态，若出现固有层腺体萎缩，炎性细胞浸润则提示造模成功。将成模大鼠随机分为模型组、加味柴芍六君汤组，每组6只。

2.2 给药

按人与动物间药物剂量换算的常规算法[8]，大鼠的给药量约为人的6倍，正常组和模型组予等体积(10 mL/kg)生理盐水灌胃，加味柴芍六君汤组予0.69 g/mL加味柴芍六君汤灌胃，每日1次。3组均连续干预4周。

2.3 取材

灌胃结束后，大鼠禁食不禁水24 h，称取大鼠体质量，用20%乌拉坦(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，麻醉后迅速剖腹，行腹主动脉采血。断头处死大鼠，取出全胃并从幽门处沿胃大弯剪开胃腔，冰生理盐水清洗干净胃内容物，取胃窦部修剪为5 mm×5 mm的组织块放入4%的多聚甲醛溶液固定24 h，其余胃黏膜组织置于冻存管，-80 ℃储存备用。

2.4 观察及检测指标

2.4.1 动物一般情况及体质量

观察各组大鼠毛发色泽、精神状态、活动度、粪便性状等一般情况变化，并于造模前后、干预后分别记录3组大鼠体质量。

2.4.2 HE染色法观察胃黏膜组织病理

将4%多聚甲醛固定后的胃黏膜组织取出，梯度脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、连续切片，切片厚度为4 μm，捞片后烘干脱蜡，进行HE染色，封片，光学显微镜下观察各组大鼠胃黏膜组织病理形态。

2.4.3 酶联免疫吸附测定IL-1β、IL-6含量

按照ELISA试剂盒说明配制标准品和样品，用酶标仪测定450 nm处标准品的浓度及吸光度值并绘制标准曲线。将样品吸光度值代入标准曲线，计算各样品中IL-1β、IL-6的实际浓度。

2.4.4 qPCR法检测胃黏膜HIF-1α mRNA表达

将组织从-80 ℃冰箱取出冰上解冻，称取50 mg胃黏膜组织进行RNA提取，经75%乙醇清洗后用紫外-可见分光光度计测RNA浓度。根据逆转录试剂说明书配制反应体系，设置逆转录反应条件。将反应完的cDNA吸取1 μL用于下一步的qPCR反应，其余放入-20 ℃储存。按说明书配制qPCR反应体系，置于荧光定量PCR仪中进行扩增反应，扩增条件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40个循环。采用β-actin作为内参基因，用2-△△Ct法计算胃黏膜HIF-1α mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 胃黏膜组织β-actin、HIF-1α mRNA引物序列

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 模型评价

3.1.1 动物一般情况及体质量比较

正常组大鼠毛发洁白有光泽，活泼好动，行动敏捷，大便性状气味无殊；模型组大鼠毛发粗硬，色淡黄无光泽，无精打采，安静扎堆，大便时干时稀，气味臭秽；加味柴芍六君汤组大鼠毛发情况、精神状况、活动度、大便性状等较模型组有明显改善。造模前，正常组与造模组大鼠体质量无明显差异(P>0.05)。造模后，与正常组相比，造模组大鼠体质量显著减轻(P<0.01)，见表2。连续干预4周后，计算各组大鼠的体质量增量。与正常组相比，模型组大鼠的体质量增量下降(P<0.05)。与模型组相比，加味柴芍六君汤组大鼠的体质量增量显著增加(P<0.01)，见表3。

表2 两组大鼠造模前后体质量比较

表3 各组大鼠体质量增量比较

3.1.2 胃黏膜组织病理比较

正常组大鼠胃固有层腺体排列整齐，未见腺体萎缩、减少；模型组大鼠胃黏膜固有层腺体排列紊乱，局部腺体萎缩、减少，腺腔增大，炎性细胞浸润，可见多处散在出血点；与模型组相比，加味柴芍六君汤组大鼠腺体排列较整齐，腺体萎缩改善，仍可见散在出血点。如图1所示。

图1 各组大鼠胃黏膜组织HE染色病理图(×400)

3.2 各组血清IL-1β、IL-6含量

与正常组相比，模型组大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6含量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，加味柴芍六君汤组大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6含量显著降低(P<0.01)。见表4。

表4 各组大鼠血清IL-1β、IL-6含量比较

3.3 各组胃黏膜HIF-1α mRNA表达

与正常组相比，模型组大鼠胃黏膜组织HIF-1α mRNA表达量明显上调(P<0.05)；加味柴芍六君汤组大鼠胃黏膜组织HIF-1α mRNA表达量与模型组表达量相比有下调趋势，差异无统计学意义(P>0.05)，见表5。

表5 各组大鼠胃黏膜组织HIF-1α表达水平比较

4 讨论

CAG归属于中医学“胃痛”“胃痞”“嘈杂”等范畴，中医学认为，CAG病位在胃，与肝、脾密切相关，肝与脾在生理上密切相关，病理上相互影响[9-10]。“土得木而达”，脾土得肝木之疏泄，脾胃升降协调，运化功能健旺；而“木赖土以培之”，脾为气血生化之源，脾气运化水谷精微，输送滋养肝木，才能发挥其正常的生理功能。血液的生成和循行同样需要肝脾相互协作，脾气健运，气血化源充足，肝血充足，则疏泄正常，气机调畅，气血运行方能无阻。叶天士在《临证指南医案》中指出慢性迁延性疾病的发生发展规律是“初为气结在经，久则血伤入络”，CAG病程长，病情反复，血瘀是CAG病情进展的关键因素[11-12]，肝郁脾虚是CAG的重要病理特点，而柴芍六君汤是临床上治疗慢性萎缩性胃炎肝郁脾虚型的常用方剂。本研究在柴芍六君汤的基础上加入活血祛瘀、通经止痛之丹参以及破血行气、消积止痛之莪术组成加味柴芍六君汤，旨在探讨加味柴芍六君汤针对肝郁脾虚血瘀病机治疗CAG的炎症相关生物学机制。

本实验通过动物一般情况、体质量以及胃黏膜组织病理形态比较来进行模型评价。结果显示，模型组大鼠毛发粗硬，色淡黄无光泽，无精打采，安静扎堆，大便时干时稀，气味臭秽，成模大鼠体质量较正常组大鼠显著减轻，其宏观表征符合肝郁脾虚的病机特点。模型组大鼠胃固有层腺体萎缩，符合CAG的病理诊断标准，说明CAG疾病模型已成功建立。

IL-1β是由单核-巨噬细胞分泌的炎症因子，能引发级联反应致使白细胞聚集、浸润，放大炎症反应，并通过影响炎症与免疫二者平衡[13-14]，促进肿瘤的发生发展。其能诱导内皮细胞活化，在CAG胃黏膜炎症反应中起调节作用，但IL-1β水平过高会损伤胃黏膜。研究显示[15]，IL-1β水平在慢性非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胃癌3个阶段有显著差异，呈升高趋势，并与胃癌的生长、浸润及转移明显相关。血清IL-6是可调节免疫细胞(B细胞和T细胞)参与机体免疫应答，促进炎症反应的一种多效炎症细胞因子[16]。较多研究表明[17-18]，IL-1β、IL-6在炎性反应的发生发展过程中起重要作用，可用于探讨胃黏膜损伤的严重程度及炎症分级。

HIF-1α是对缺氧水平产生细胞免疫应答的主要调节因子，可以激活多种缺氧反应基因的表达，其在常氧环境下不稳定，易被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解，但在缺氧环境下可以稳定表达[19]。缺氧是肿瘤微环境的一个常见特征，可诱导HIF-1α表达水平上调，增强肿瘤细胞对低氧环境的适应能力[20]，增加CAG的癌变风险。

本实验研究结果显示，模型组血清IL-1β、IL-6含量显著升高，胃黏膜组织HIF-1α mRNA表达水平较之正常组上调，表明CAG胃黏膜损伤程度较为严重，炎症反应明显，胃黏膜局部缺氧环境形成，癌变风险增加。加味柴芍六君汤干预后IL-1β、IL-6含量显著减轻，HIF-1α mRNA表达水平较模型组表现出下调的变化趋势，说明药中病机，能促进CAG胃黏膜损伤修复，减轻炎症反应，可能具有改善胃黏膜缺氧环境的作用，但效果不甚明显。

综上所述，加味柴芍六君汤可能是通过降低血清IL-1β、IL-6含量，下调胃黏膜缺氧诱导因子HIF-1α过表达，从而改善胃黏膜局部缺氧环境，减轻炎症反应，逆转胃黏膜萎缩。