小檗碱对不同茶树炭疽菌的抑菌活性及作用机制

张志鹏，程庆华，谢靖康，万宇鹤，童华荣，陈应娟

小檗碱对不同茶树炭疽菌的抑菌活性及作用机制

张志鹏，程庆华，谢靖康，万宇鹤，童华荣，陈应娟*

西南大学食品科学学院茶学系/食品科学与工程国家级实验教学示范中心，重庆 400715

为研究小檗碱在茶炭疽菌（）引起的茶树叶部病害防治中的应用前景，以松针炭疽菌（）、喀斯特炭疽菌（）、重庆炭疽菌（）、山茶炭疽菌（）和胶孢炭疽菌（）5种不同茶炭疽菌为研究对象，研究了小檗碱对不同炭疽菌的抑菌活性，并比较了其抑菌活性差异。研究结果表明，小檗碱对和的抑制效果最好，在质量浓度为12 mg·mL-1时达到100%抑菌率，其次是、和，其抑菌中浓度（Concentration for 50% of maximal effect，EC50）分别为2.828、3.288、4.164、4.778、5.104 mg·mL-1。显微镜镜检发现，小檗碱对5种炭疽菌的菌丝和分生孢子均存在明显影响，随小檗碱浓度的增加，部分菌丝出现不规则膨大现象，分生孢子形态也出现扭曲变形；生物活性检测发现，小檗碱处理后，不同炭疽菌的细胞结构均出现不同程度损伤，细胞膜的通透性增大、细胞氧化应激反应增强。研究结果明确了小檗碱对茶树炭疽菌的抑菌活性及应用前景，为炭疽菌引起的茶树病害的防治提供了新的途径及理论依据。

小檗碱；茶炭疽菌；抑菌活性；作用机制

茶树病害的防治一直是茶学研究的重要方向，是茶叶安全生产的重要内容。由炭疽菌（）引起的茶云纹叶枯病（Brown blight disease）是茶园中的常见病害，在世界各茶叶种植区均有不同程度的发生。炭疽菌主要为害茶树叶部，一般从茶树叶片背部的毛孔侵入，经8～15 d潜伏期后开始形成病斑，在温暖湿润的条件下易造成该病大面积的暴发流行，导致茶叶产量和品质下降，造成严重的经济损失，严重阻碍茶产业的发展[1-3]。目前，炭疽菌引起的茶树病害防治仍以化学农药为主，农药的不当或过量使用不仅会出现茶叶农残超标等问题，还会加速茶园生态环境的恶化，造成巨大的经济损失和资源浪费。因此，筛选高效、低毒、低残留的防治方法是茶产业发展的必然趋势。

小檗碱（Berberine）又名黄连素，属异喹啉类生物碱，分子式为C20H18NO4，是植物黄连的根状茎中提取的主要有效成分，也是黄连、黄柏、功劳木、三颗针等中药材中的主要有效成分[4-5]。最新研究表明，小檗碱具有良好的抗细菌、抗真菌、抗炎和抗癌等功效，在农业上兼具杀虫、杀菌和除草等活性[6-10]。目前，小檗碱凭借其杀菌活性在植物上被广泛应用，但未见在茶树上应用的相关报道。本研究以5种不同茶树炭疽菌种为研究对象，研究小檗碱对不同茶炭疽菌的抑菌活性，进一步通过显微镜镜检分析、生物活性检测等研究小檗碱对茶树炭疽菌的作用机制，以明确小檗碱在炭疽菌引起的茶树病害防治中的应用前景，以期为茶树炭疽菌的病害防治提供新的途径，为茶园安全生产做贡献。

1 材料与方法

1.1 供试培养基与小檗碱母液

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato dextrose agar，PDA）配制：将马铃薯去皮洗净后，取200 g切成小块，加1 L水煮至马铃薯可以轻易被戳碎，用8层纱布过滤之后，将滤液倒回洗净的锅中小火加热，加入20 g葡萄糖和20 g琼脂，搅拌至溶解，将滤液定容至1 L，分装，高压灭菌后备用。

马铃薯葡萄糖肉汤培养基（Potato dextrose broth，PDB）为不加琼脂的PDA液体培养基。

小檗碱母液配制：精准称取小檗碱粉末10 g置于100 mL的烧杯中，加入适量的二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，再用ddH2O配制成质量浓度为600.0 mg·mL-1的母液，转移至50 mL容量瓶中，用ddH2O将烧杯洗涤2～3次后定容到刻度线处，过滤除菌后待用。

1.2 菌株

本研究所采用茶炭疽菌种是2016年至2019年在重庆市茶叶种植区采集的茶树感病样本，经形态学和多基因遗传进化分析鉴定为松针炭疽菌（）、喀斯特炭疽菌（）、重庆炭疽菌（）、山茶炭疽菌（）和胶孢炭疽菌（）[1,11-12]。

1.3 试验方法

1.3.1 抑菌活性测定

取保存备用的灭菌PDA，用微波炉加热至PDA全部融化，待冷却至50℃时，取一定量的小檗碱母液在超净台上加入到PDA中，分别配制成1.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 mg·mL-1的浓度梯度，将培养5 d的菌种打取菌饼接种至不同浓度的含药培养基中，(26±2)℃培养5～7 d，观察菌落生长情况，在6 d时用相机拍摄菌落状态，每次试验设置两个平行，试验重复3次，通过SPSS 20.0计算抑菌中浓度（Concentration for 50% of maximal effect，EC50）和显著性分析，Adobe Photoshop CS5处理菌丝图片。

菌落生长抑制率计算公式：

式中，C为对照菌落直径，T为处理菌落直径。

1.3.2 菌丝和分生孢子的培养及形态观察

取灭菌过的PDA，将PDA分别配制成含EC50和质量浓度为10 mg·mL-1的小檗碱培养基，以空白PDA为阴性对照（CK），用打孔器（d=7 mm）取在PDA上培养5 d的炭疽菌饼分别接种于CK、含EC50和10 mg·mL-1浓度小檗碱的培养基上，(26±2)℃培养箱中培养5～10 d，在显微镜下观察菌丝和分生孢子生长形态特征。

1.3.3 相对电导率的测量

将PDA上培养5 d的炭疽菌菌落用打孔器（d=7 mm）各取两块菌块，接入含不同浓度小檗碱的PDB中，在26℃，160 r·min-1条件下振荡培养72 h，用电导率仪测量培养液的相对电导率（Relative conductivity），然后将培养液加热至沸腾，待冷却后再测1次电导率。试验重复两次，每次3个重复。

相对电导率计算公式：

1.3.4 丙二醛（MDA）含量的测定

将PDA上培养5 d的炭疽菌菌落打取菌饼接种于PDB培养液中，在26℃，160 r·min-1条件下培养48 h后，加入小檗碱使其终质量浓度为12.0 mg·mL-1，以不加药剂的PDB为对照。分别在药剂加入后0、12、24 h从培养液中取待测液。

取0.5 mL待测液，加入0.5 mL硫代巴比妥酸（0.67%，/），混合加热30 min，待其冷却后，低速离心10 min后测定吸光度，测定前用5%三氯乙酸溶液调零，分别在450、532 nm和600 nm处测定吸光值并计算MDA含量，μmol·mL-1。

MDA含量=[6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450]×提取液

1.4 数据分析

试验数据利用Excel 2016进行初步整理分析，通过SPSS 20.0软件进行抑菌率分析、单因素方差分析，并建立毒力回归方程，计算相关系数和EC50，利用Tukey进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 小檗碱对5种炭疽菌的抑菌活性比较

如图1所示，小檗碱对5种炭疽菌均具有较好的抑菌活性，但对不同炭疽菌种表现出明显的差异性，抑菌效果由高到低依次为、、、和，其EC50分别为2.828、3.288、4.164、4.778、5.104 mg·mL-1（表1），表明和对小檗碱更为敏感。在小檗碱质量浓度为12.0 mg·mL-1时，和的菌落生长完全被抑制，达到100%的抑菌效果，而对和的抑菌效果分别为85.51%、84.31%、89.58%；小檗碱质量在15 mg·mL-1时对和的抑菌活性也达到100%。

2.2 小檗碱对炭疽菌菌落生长情况的影响

如图2所示，在PDA上正常培养7 d时，菌落正面整体呈白色，反面颜色呈浅黄色；菌落表面菌丝呈灰白色，菌落中心呈现明显的橙红色；正面整体为白色，反面为淡黄白色，菌丝生长均匀；菌落表面菌丝呈灰白色，背面为淡橙红色，尤其是在菌落中央颜色较深，菌丝整体生长均匀；菌落白色，菌丝生长茂密且均匀。不同质量浓度的小檗碱（1～12 mg·mL-1）处理后，培养基由于药剂的加入呈现由浅黄色到深黄色的颜色变化，5种炭疽菌的菌落生长均受到了明显的抑制，但菌落形态变化不大。随小檗碱质量浓度增大，在12 mg·mL-1时，5种炭疽菌的菌丝呈现簇状生长状态，生长发育受到显著抑制。

图1 不同浓度小檗碱对5种炭疽菌的生长抑制率

表1 小檗碱对5种炭疽菌的毒力分析

图2 5种炭疽菌在不同浓度小檗碱作用下的菌落生长情况

2.3 小檗碱对不同炭疽菌菌丝生长的影响

如图3所示，正常生长情况下，5种炭疽菌的菌丝整体生长均匀，但随小檗碱浓度的升高，不同炭疽菌种的菌丝数量急剧减少，生长形态也发生了明显的变化。EC50浓度处理下，和的部分菌丝形态呈现不均匀增粗或局部不规则膨大现象，而其他3种炭疽菌的菌丝形态在低浓度小檗碱作用下变化不大。随着小檗碱浓度的增大，和的菌丝生长不正常状态加剧，呈现较多短小分枝生长明显受到抑制，和其他2种炭疽菌的菌丝生长也受到不同程度的影响，但程度明显低于和。

2.4 小檗碱对炭疽菌分生孢子的影响

如图4所示，正常生长状态下，和的分生孢子均呈圆柱状，末端呈钝形或微向底部狭窄，整体透明，内部无隔膜，大小（长×宽）分别为(11.7～18.9)μm×(4.1～7.61)μm、(12.60～18.50)μm×(4.30～7.50)μm和(14.1～18.4)μm×(6.8～8.6)μm；的分生孢子呈纺锤形，透明，无隔膜，大小为(10.9～17.3)μm×(3.5～5.8)μm；分生孢子呈圆柱形，两端钝或向基部狭窄透明，无隔膜，大小为(11.1～15.3)μm×(5.1～7.4)μm[1,11-12]。在小檗碱EC50浓度处理下，5种炭疽菌的部分分生孢子生长受到一定程度的抑制，但表现不明显，随着小檗碱浓度的升高，分生孢子数量大幅度减少，在10 mg·mL-1时，未观察到分生孢子的生长，而其他4种炭疽菌的部分分生孢子形态发生了显著变化，主要表现为分生孢子两端不对称生长、整体伸长或缩短、局部不规则膨大等，表明高浓度小檗碱能明显抑制分生孢子的生长。

图3 小檗碱对茶炭疽菌菌丝生长的影响（标尺=10 μm）

图4 小檗碱对茶炭疽菌分生孢子生长的影响（标尺=10 μm）

2.5 小檗碱对茶炭疽菌细胞膜通透性的影响

细胞相对电导率的大小可以作为衡量细胞膜透性的指标之一[13]。试验结果显示，在正常振荡培养72 h后，5种炭疽菌的相对电导率较高，在88.94%～92.33%，这可能是菌落培养时间较短造成的差异，但不同菌种之间其相对电导率存在一定的差异。不同浓度的小檗碱处理后，5种炭疽菌的相对电导率整体呈增高趋势，但在小檗碱浓度较低时，即1 mg·mL-1时，和的相对电导率与对照（处理0 h）相比有不同程度的降低，这可能是由于低浓度药剂对炭疽菌的抑菌活性较小，对不同炭疽菌细胞膜通透性的作用表现出一定程度的不稳定性和差异；之后随小檗碱浓度的升高表现为增高趋势，表明在小檗碱的作用下，5种炭疽菌的细胞膜均出现不同程度损伤，且随小檗碱浓度的增大损伤程度加剧（图5）。

2.6 小檗碱对茶炭疽菌细胞抗氧化能力的影响

MDA是细胞在逆境胁迫下脂质过氧化作用的主要产物之一，MDA的含量是衡量细胞脂质过氧化程度的重要指标之一[14]。如图6所示，处理0 h时，5种炭疽菌的MDA含量无显著变化；在小檗碱处理12 h时，5种炭疽菌的MDA含量均急剧升高，表明在小檗碱处理下，炭疽菌的细胞氧化应激反应急剧加强，细胞脂质过氧化的程度加剧；在处理12～24 h内，5种炭疽菌的MDA含量又呈急剧下降的趋势，表明在处理12 h后，炭疽菌细胞开始出现大量死亡，氧化应激反应减弱，MDA含量下降。整体来说，5种炭疽菌的MDA含量存在相似的变化规律，但不同炭疽菌的变化幅度存在一定的差异性。

3 讨论与结论

由炭疽菌引起的茶云纹叶枯病是茶树的主要叶部病害之一[1-2]，目前，茶树病虫害防治还是以化学防治为主，但农药残留和病原抗药性等问题突出，而植物源药剂开发是解决这个问题的绿色、安全、有效的途径之一。小檗碱，是一种异喹啉类生物碱，以其显著的广谱抗菌性，被广泛应用于临床疾病的治疗方面，据报道，小檗碱能有效抑制金黄色葡萄球菌、肠球菌和链球菌，包括多重耐药性的结核杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[7-9]。目前，小檗碱作为植物杀菌剂，被证实对桃褐腐病菌、苹果轮纹病菌和番茄早疫病菌具有显著的抑菌效果[5,7,15]，可见，小檗碱具有开发成农用化学抑菌剂的潜力，而小檗碱在茶树病虫害防治领域的研究却未见有报道，防治效果尚不明确。本研究以5种不同茶树炭疽菌为研究对象，证实了小檗碱对5种炭疽菌均具有较好的抑菌活性，但对不同炭疽菌种表现出明显的差异性，明确了小檗碱在茶炭疽菌引起的茶树病害防治中的应用前景。

图5 不同浓度小檗碱对茶炭疽菌相对电导率的影响

图6 小檗碱处理后茶炭疽菌MDA含量的变化

研究证实，小檗碱会抑制麦角甾醇的合成，使细胞膜通透性增大，从而造成细胞内物质如核酸、蛋白质的泄露，小檗碱也会造成菌体细胞膜膜电位去极化和脂质过氧化。小檗碱防治引起的番茄早疫病的显微镜镜检发现，小檗碱处理后的菌丝形态发生了明显变化，菌丝表面变得褶皱、凹陷，并且随小檗碱浓度的增大，病原菌出现质壁分离现象[5,7]，因此，推测小檗碱通过抑制细胞膜来发挥抑菌功效。小檗碱处理后病原菌相对电导率明显增加，说明小檗碱造成了菌体细胞的渗漏和胞内物质外流[5,7]。这些研究结果与本研究中小檗碱对茶树炭疽菌的作用机制较为一致，小檗碱对5种不同炭疽菌的菌丝和分生孢子生长均存在一定程度的影响，随小檗碱浓度的增大，炭疽菌菌丝出现不规则膨大现象，部分分生孢子形态也出现扭曲变形，菌体的细胞结构出现不同程度损伤，细胞膜的通透性增大，细胞氧化应激反应增强，这为小檗碱在炭疽菌引起的茶树病害防治研究提供了理论依据。但在农业生产上，长期单一化学药剂的使用易使病原菌抗药性增强，药剂防治效果降低。药物复配是两种或者两种以上不同作用机制的药物按照一定的配比联合使用，利用药剂之间的协同增效作用，达到减少用量、节约成本、提高防效等效果[16-17]。两种或多种杀真菌剂的混合使用策略已达数十年，己成功控制多种作物的真菌病害[18-19]，因此，后续开展小檗碱药剂复配研究将对茶树病害的长期、高效防治具有重要意义。

本研究以5种不同茶树炭疽菌为研究对象，证实了小檗碱对不同炭疽菌的抑菌活性，并发现小檗碱对不同茶树炭疽菌的抑菌效果存在明显差异，抑菌效果由高到低依次为、、、、，其EC50分别为2.828、3.288、4.164、4.778、5.104 mg·mL-1，表明和对小檗碱更为敏感。研究结果明确了小檗碱对由炭疽菌引起的茶云纹叶枯病病害防治中的应用前景。显微镜镜检发现，在小檗碱处理下，炭疽菌的菌丝和分生孢子的生长均受到不同程度的影响，随小檗碱浓度的增大，部分菌丝和分生孢子形态出现不同程度的变化，菌体的细胞结构也出现不同程度损伤，细胞膜通透性增大，细胞脂质过氧化加剧，从而抑制了病原菌的生长发育，初步明确了小檗碱对不同炭疽菌的抑菌机制，为小檗碱在茶树病害防治中的应用提供了理论基础。

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The Antifungal Effect and Mechanism of Berberine on DifferentSpecies Causing Tea Brown Blight Disease

ZHANG Zhipeng, CHENG Qinghua, XIE Jingkang, WAN Yuhe, TONG Huarong, CHEN Yingjuan*

National Demonstration Center for Experimental Food Science and Technology Education, Department of Tea Science, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

To explore the application prospects of berberine on the prevention and control of tea diseases, the antifungal activity of berberine against five differentspecies (,,,and) were studied and the differences in antifungal activities were compared. The results show that berberine has the best inhibitory effect on bothand, reaching 100% at the concentration of 12 mg·mL-1, followed by,and. The EC50(Concentration for 50% of maximal effect) of the fivespecies were 2.828, 3.288, 4.164, 4.778 mg·mL-1and 5.104 mg·mL-1, respectively. The conidial and hyphal morphology of fivespecies under the treatment of berberine were examined, showing that berberine had a significant impact on the mycelial and conidial growth of fivespecies. With the increase of berberine concentration, part of hyphae expanded irregularly and the conidia grew abnormally. Results of the biological activity ofspecies show that the cell structure was damaged, the permeability of cell membrane was increased and the cell oxidative stress response was enhanced. Results of this study firstly confirm the antifungal activity and application prospects of berberine againstspecies, which provided a new approach and theoretical basis for the prevention and control of tea disease caused by.

berberine,, antifungal activity, mechanism

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2022)03-367-09

2021-12-20

2022-03-16

重庆市技术创新与应用发展专项重点项目（cstc2021jscx-tpyzxX0010）、大学生创新创业训练项目（202110635062和S202110635293）、中央高校基本业务费重点项目（XDJK2020B046）

张志鹏，男，本科在读，主要从事茶树栽培与病虫防控相关研究，2072312650@qq.com。*通信作者：cyj8@swu.edu.cn

（责任编辑：黄晨）