UFLC法同时测定黄芩汤中3个有效成分的含量

崔 悦，汤鑫淼，2，范琢玉，2，关 皎，朱鹤云*，冯 波* (.吉林医药学院药学院，吉林 吉林 3203；2.延边大学药学院，吉林 延吉 33002)

黄芩汤是张仲景所著《伤寒论》中的经典名方，包括黄芩、甘草、白芍和大枣四味药材，其中黄芩是君药，芍药是臣药，甘草是佐药，大枣是使药[1]。文献报道，黄芩汤对于溃疡性结肠炎具有良好的治疗作用[2]，其有效成分能够转运至大肠，对泻痢等疾病发挥出局部治疗作用[3]。

黄芩作为黄芩汤中的君药，含有多种黄酮类化合物如汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎和抗溃疡作用，发挥着主要的治疗作用[4-5]。汉黄芩素可通过调控Ywhaz蛋白抑制结肠癌细胞增殖及侵袭转移；黄芩素可抑制HeLa细胞和U14宫颈癌荷瘤小鼠肿瘤生长[6]。因此分析黄芩汤中成分对其质量控制和深入研究具有重要意义。目前，有关黄芩汤成分的测定主要是采用高效液相色谱法[8]，尚缺乏黄芩汤中黄芩的多种有效成分的含量测定，且已有方法分析时间较长、灵敏度较差。超快速液相色谱(ultra-fast liquid chromatography，UFLC)分析方法分离效果好，分析时间短，节省溶剂，适合中药复方成分的分离分析[8-9]。本实验建立了一种UFLC法可同时测定黄芩中汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量，为黄芩汤的质量控制提供依据。

1 材料和方法

1.1 仪器与材料

Prominence UFLC型超高快速液相色谱仪(日本岛津)；XK96-A快速混匀器(江苏新康医疗器械有限公司)；N-1300-WB型旋转蒸发仪(日本EYELA东京理化器械株式会社。

黄芩、甘草、芍药和大枣药材购买自吉林大药房。乙腈和甲醇均为色谱纯，购自美国Fisher公司。对照品均购自成都普菲德生物技术有限公司：汉黄芩苷(141214，纯度>98%)，黄芩素(150320，纯度>98%)，汉黄芩素(150319，纯度>98%)。

1.2 色谱条件

色谱柱为Shimadzu Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm，2.2 μm)；流动相由0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)组成，梯度洗脱(0～30 min，10%～70%B)，流速0.4 mL/min，在274 nm波长下检测，柱温保持在35 ℃，进样量为5 μL。汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素典型色谱图见图1。

1.汉黄芩苷;2.黄芩素,3.汉黄芩素

1.3 对照品溶液的配制

分别称取5 mg汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对照品，用甲醇定容至5 mL，配制成浓度为1.0 mg/L的各对照品储备液。

1.4 供试品溶液的制备

1.4.1黄芩汤的制备

称取黄芩9 g，炙甘草、白芍、大枣各6 g，加入10倍量的乙醇，然后将其煮沸1 h为第1次煎煮，趁热过滤，残渣再次加入8倍量的乙醇煮沸1 h为第2次煎煮，将第1次与第2次回流提取的滤液混合，合并于干净的容器内，用旋转蒸发仪将其浓缩至80 mL，置于容量瓶中，所得即黄芩汤。

1.4.2黄芩汤供试品溶液制备

精密吸取“1.4.1”中黄芩汤0.1 mL，加入甲醇0.9 mL，涡旋5 min，用0.22 μm滤膜滤过，续滤液即为供试品溶液。

1.4.3阴性样品的制备

除不加黄芩外，其余按照“1.4.1”项下制备得不含黄芩的阴性样品溶液。

1.5 线性关系考察

分别精密吸取“1.3”中对照品储备液，以甲醇为溶剂依次稀释配制成浓度为1、2、5、10、20、50 mg/L的混合对照品溶液，按照上述色谱条件分别进样，得到不同浓度下不同对照品对应的峰面积。分别以各成分的浓度X(mg/L)为横坐标，以相对应的色谱峰面积Y为纵坐标，进行线性回归。

1.6 精密度试验

吸取10 mg/L的混合对照品溶液5 μL，连续进样6次。

1.7 稳定性试验

取同一批次的黄芩汤样品溶液，分别在放置不同时间(0、2、4、8、12、24 h)后,按上述色谱条件进样分析。

1.8 重复性实验

同法制备6份黄芩汤样品后制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进样分析。

1.9 回收率试验

分别向已知含量的黄芩汤样品(汉黄芩苷0.132 g/L、黄芩素0.264 g/L和汉黄芩素0.140 g/L)9份中加入相当于样品中三种成分含量80%、100%、120%的对照品溶液各3份，计算其回收率。

1.10 样品含量测定

取6批黄芩汤样品制成供试品溶液，分析并计算3种成分的含量。

2 结 果

2.1 线性关系考察

三种成分的线性回归方程分别为：

汉黄芩苷Y=52 800X+12 281；r=0.999 9

黄芩素Y=142 239X-1 401.8；r=0.999 9

汉黄芩素Y=89 113X+22 473；r=0.999 9

表明其在1～50 mg/L范围内有良好的线性关系。

2.2 精密度试验

三种成分峰面积的RSD分别为0.6%、1.3%和0.6%，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验

三种成分峰面积的RSD分别为1.9%、0.9%和0.8%，表明样品稳定性良好。

2.4 重复性试验

三种成分的含量分别为汉黄芩苷0.132 g/L(RSD为1.0%)、黄芩素0.264 g/L(RSD为0.9%)和汉黄芩素0.140 g/L(RSD为0.9%)，说明方法具有良好的重复性。

2.5 回收率试验

汉黄芩苷的平均回收率为98.5%,平均RSD为0.87%;黄芩素的平均回收率为98.7%,平均RSD为0.63%;汉黄芩素的平均回收率为98.5%,平均RSD为0.57%。

2.6 含量测定

三种成分的含量见表1。

表 1 黄芩汤样品中三种成分的含量(g/L)

3 讨 论

采用PDA检测器对样品在200～400 nm波长范围内扫描，结果发现汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素在274 nm处同时具有较高的响应，故最终确定选择274 nm波长下进行检测。

黄芩汤组方药材分别为黄芩、甘草、白芍和大枣。研究发现，黄芩汤方中含有的化学成分具有良好的药理作用，因此对方中有效成分的研究具有重要意义[10]。由于在黄芩汤中黄芩为君药，因此对其化学成分的分析对于黄芩汤的相关研究具有代表性意义。本实验选取了黄芩中三种活性成分，即汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素，建立了UFLC方法同时对黄芩汤中这三种成分进行检测。与已有高效液相色谱法比较，具有分离效果更佳、分析速度更快等优点[1，7]，可为黄芩汤的药效物质基础和相关质量标准的建立提供参考。

本研究建立了灵敏度高、专属性强、同时测定黄芩汤中汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量的UFLC方法，可为黄芩汤的深入研究提供参考。