健脾益肾活血方对膜性肾病大鼠肾组织Nephrin和Podocin表达的影响

关 冰，田 雪，李伟男，吴艳萍，金劲松，袁 军

(湖北省中医院/湖北中医药大学附属医院，湖北 武汉 430061)

膜性肾病是成人肾病综合征最常见的病因，约占原发性肾小球疾病的16.8%，位居原发性肾小球疾病的第二位，30%～40%的患者在5～15年之间进展为终末期肾脏病[1]。本病主要采用激素联合环磷酰胺、钙调磷酸酶抑制剂和利妥昔单抗等药物治疗，但长期疗效不理想，不良反应较明显，且复发率高。目前认为足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin与Podocin的分离及表达的减少是导致膜性肾病蛋白尿发生发展的重要机制[2]。中医药治疗膜性肾病的研究颇多，患者中医辨证以脾肾气阳虚证最为多见，实证以血瘀证占比最多[3]，健脾益肾活血方即根据该病特点而设。为探讨健脾益肾活血方治疗 膜性肾病的作用机制，本研究通过被动型Heymann肾炎大鼠模型，观察了该方对膜性肾病大鼠肾组织中Nephrin与Podocin表达的影响。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康雄性SD大鼠40只，体重190～220 g，购自湖北省实验动物研究中心，动物合格证号：SCXK(鄂)2020-0018。大鼠饲养于湖北省中医院动物实验中心，室内温度控制在20 ℃左右，相对湿度50%～70%。

1.2主要试剂 羊抗鼠Fx1A血清(Probetex，批号：PTX-002S)；抗Nephrin抗体C端(Abcam，批号：ab183099)；抗NPHS2 抗体(Abcam，批号：ab93650)；兔抗鼠IgG H&L (HRP，Abcam，批号：ab6734)；抗C3抗体(Abcam，批号：ab200999)；FITC山羊抗兔IgG(Bioswamp，批号：SAB43712)；抗荧光衰减封片剂(含DAPI，Solarbio，批号：S2110)。

1.3药物 健脾益肾活血方组成：黄芪30 g、党参15 g、淫羊藿15 g、白术15 g、当归12 g、川芎15 g、益母草30 g、穿山龙30 g，药物购自江阴天江药业有限公司。盐酸贝那普利片(北京诺华制药有限公司，国药准字H20000292，批号：X3104)。药物剂量参照《医学实验动物学》人与动物之间的用药剂量换算，200 g大鼠用药约为70 kg体重人服用剂量的6.3倍。

1.4实验方法 将40只健康SPF雄性大鼠随机分为正常组、模型组、贝那普利组、健脾益肾活血组，每组10只。各组大鼠适应性喂养后检测24 h尿蛋白定量均小于10 mg后开始造模。正常组大鼠一次性尾静脉注射生理盐水0.6 mL/100 g，模型组、贝那普利组、健脾益肾活血组一次性尾静脉注射Fx1A血清0.6 mL/100 g，造模后测定24 h尿蛋白定量>10 mg则为模型建立成功(造模后贝那普利组及健脾益肾活血组各死亡1只，予以剔除)。造模后第1天开始，贝那普利组给予0.15 mg/mL盐酸贝那普利片悬混液灌胃，健脾益肾活血组给予生药浓度为2.5 g/mL的健脾益肾活血汤灌胃，正常组、模型组给予等量生理盐水灌胃，均1次/d，每次3 mL，连续灌胃4周。健脾益肾活血组在灌胃第3周时死亡1只，予以剔除。

1.5标本采集与检测

1.5.124 h尿蛋白定量检测 用代谢笼收集各组大鼠灌胃1周、2周、3周、4周后的24 h尿液，检测24 h尿蛋白定量。

1.5.2血生化指标检测 采用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉并处死大鼠，心脏取血，离心后取上层，检测血清总蛋白、血清白蛋白、血肌酐、总胆固醇、三酰甘油水平。

1.5.3肾脏组织病理观察 ①摘取各组大鼠双侧肾脏，去掉包膜，分切肾组织，部分进行多聚甲醛固定后制备石蜡切片。将3 μm石蜡切片脱蜡后按常规方法进行PAS、Masson染色。②另取石蜡切片常规脱蜡水化，高温高压抗原修复冷却，PBS冲洗3次，每次3 min，3%过氧化氢避光孵化15 min，滴加一抗(IgG 1∶500、C3 1∶200)4 ℃过夜，PBS洗3次，每次3 min；滴加二抗，室温孵育30 min,完毕后PBS冲洗3次，每次3 min，加入300 μL 抗荧光淬灭封片液(含DAPI)封片，免疫荧光显微镜下观察IgG和C3沉积情况。③取部分肾组织，切成小块后浸入2.5%戊二醛-PBS溶液中固定，日立(Hitachi)透射电镜(型号：HT7800)下观察肾脏足细胞足突变化及电子致密物沉积情况。

1.5.4肾组织中Nephrin、Podocin免疫荧光检测 取肾组织冰冻切片，用丙酮固定15 min后用1 mL PBS洗3次，每次3 min，弃去PBS；加入1 mL 3% BSA，37 ℃封闭1 h，弃去封闭液；加入300 μL PBS稀释后的抗体(兔抗大鼠Nephrin 1∶50,Podocin 1∶50)，4 ℃孵育过夜；用1 mL PBS洗2 次，每次5 min，弃去PBS；加入300 μL PBS稀释后的荧光二抗，37 ℃孵育1 h；用1 mL PBS洗2次，每次5 min，弃去PBS；加入300 μL抗荧光淬灭封片液(含DAPI)；荧光显微镜尼康(Nikon)80i观察拍照，采用NIS-Elements AR Analysis 5.21.00对图片进行强度平均值分析，用以表示Nephrin、Podocin抗体的表达量。

1.6统计学方法 应用SPSS 23.0软件进行数据统计分析。计量资料多个样本均数比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠24 h尿蛋白定量比较 造模1～4周，模型组、贝那普利组、健脾益肾活血组大鼠24 h蛋白尿定量均明显高于正常组(P均<0.05)；灌胃1周和2周后，模型组、贝那普利组、健脾益肾活血组大鼠24 h蛋白尿定量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；灌胃3周后，模型组大鼠24 h蛋白尿定量达峰值，贝那普利组及健脾益肾活血组从灌胃2周后开始逐渐降低；灌胃3周、4周后贝那普利组及健脾益肾活血组大鼠24 h蛋白尿定量均明显低于同期模型组(P均<0.05)，健脾益肾活血组与贝那普利组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1。

2.2各组大鼠血清生化指标比较 模型组、贝那普利组、健脾益肾活血组血清白蛋白水平均明显低于正常组(P均<0.05)，模型组、贝那普利组、健脾益肾活血组血清胆固醇水平和模型组、健脾益肾活血组血清三酰甘油水平均明显高于正常组(P均<0.05)，各组血肌酐水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；模型组、贝那普利组及健脾益肾活血组上述各指标水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2。

2.3各组大鼠肾脏组织病理学表现 PAS染色显示模型组、贝那普利组、健脾益肾活血组可见基底膜增厚，部分系膜基质增生。Masson染色显示：模型组、贝那普利组、健脾益肾活血组大鼠肾脏组织上皮下可见嗜复红蛋白沉积。免疫荧光染色显示：正常组大鼠肾组织中IgG和C3均为阴性，模型组、贝那普利组、健脾益肾活血组大鼠肾脏组织中IgG和C3均沿毛细血管壁呈细颗粒样沉积。电镜显示：正常组大鼠肾组织足细胞结构完整，足突排列清晰，未见融合；模型组、贝那普利组、健脾益肾活血组大鼠肾脏组织中足突弥漫性融合，基底膜弥漫增厚，上皮下电子致密物沉积。见图3。

2.4各组大鼠肾脏组织中Nephrin与Podocin表达情况 正常组大鼠肾脏组织中Nephrin与Podocin沿肾小球毛细血管襻均匀分布，阳性染色蛋白分布均匀；与正常组比较，模型组、贝那普利组、健脾益肾活血组Nephrin与Podocin分布不均且表达明显减少，Nephrin与Podocin表达平均荧光强度均明显降低(P均<0.05)；贝那普利组、健脾益肾活血组异常改变较模型组轻，Nephrin与Podocin表达平均荧光强度均明显高于模型组(P均<0.05)；健脾益肾活血组异常改变较贝那普利组轻，Nephrin与Podocin表达平均荧光强度均明显高于贝那普利组(P均<0.05)。见图4及图5。

3 讨 论

膜性肾病属中医“水肿”“尿浊”等范畴。总属本虚标实，脾肾气(阳)虚，瘀血阻滞是其基本病机[4]。从水肿而言，脾虚不能运化水湿，肾虚不能蒸腾津液，水湿内停，泛溢肌肤而为水肿。从蛋白尿而言，肾虚失其封藏，精微物质流失，脾虚失其统摄，血中精微下泄，而为蛋白尿。可见脾肾亏虚是水肿及蛋白尿的根本。气为血帅，气行则血行，气虚则血行不畅，血液凝滞，发为血瘀；阳气不足，阳虚失于温煦，气血鼓动无力，血液寒滞而凝，日久成瘀；久病易伤津耗液，津液亏虚，血脉失其濡润而脉道涩滞，血行缓慢，血液黏滞而成瘀。瘀血的形成阻碍机体气血运行，使机体虚弱更甚，加重脾肾亏虚，日久则气虚益甚，瘀水互结日趋加重，从而形成恶性循环，使水肿或蛋白尿加重，甚至出现深静脉血栓形成等并发症。因此膜性肾病的治疗当以健脾益肾活血为基础。健脾益肾活血方中黄芪味甘、性微温，归肺脾经，该药益脾肾之气以治本，固表利尿以治标，益气得以行血而化瘀，固表则能防外邪之侵袭而防变，利尿而肿消。党参、白术健脾益气，淫羊藿补肾温阳，合用以脾肾双补。当归、川芎活血化瘀，其中当归既能活血，又能补血，扶正以化瘀；川芎辛温通散，为血中气药，能通达气血；益母草、穿山龙既能活血化瘀，又能利水祛湿。诸药合用，可达健脾益肾活血之功效。该药临床用于膜性肾病的治疗效果较好，但其作用机制尚不明确，为此本研究进行了相关探讨。

被动型Heymann肾炎及阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)肾炎是研究人类膜性肾病最常用的两种动物模型。C-BSA小鼠模型通过电荷作用植入抗原形成原位免疫复合物，可以制作Ⅰ～Ⅲ期的膜性肾病，但其需要长期多次尾静脉注射，对动物损伤较大，且8周后容易导致小鼠死亡。被动型Heymann肾炎模型病变稳定，一次性尾静脉注射即可，疼痛刺激小，适用于膜性肾病的长期病变或防治研究。本实验选用被动型Heymann肾炎模型，显示在使用抗Fx1A抗体7～10 d后蛋白尿明显增多，造模3周达到最高水平，然后呈逐渐减少趋势；灌胃3周和4周后，贝那普利组及健脾益肾活血组大鼠24 h蛋白尿定量均明显低于同期模型组，健脾益肾活血组与贝那普利组比较无差异；末次灌胃结束后，各造模组大鼠血清白蛋白水平均明显低于正常组，血清胆固醇水平均明显高于正常组，与临床患者表现一致；模型组、贝那普利组及健脾益肾活血组各血清指标水平比较差异均无统计学意义。提示健脾益肾活血方可减少膜性肾病大鼠蛋白尿，但未发现对血清蛋白和血脂指标有明显影响。

蛋白尿的产生与足细胞裂孔隔膜的结构与功能失调密切相关[5]。裂孔隔膜是肾小球最重要的滤过屏障，由多种蛋白分子组成，其中Nephrin与Podocin是足细胞裂孔隔膜的重要组成分子。Nephrin与NEPH1、FAT等蛋白分子间相互作用形成裂孔隔膜的分子滤过网，Podocin则参与裂孔隔膜和细胞骨架的连接，二者对裂孔隔膜的形成具有整合作用。同时，裂孔隔膜也是信息传导平台。Nephrin介导的信号通路能导致整合素 1的激活，调节足细胞与基底膜的附着[6]。Podocin则与TRPC6相互作用, 通过作为开关确定TRPC6激活来调节裂孔隔膜的屏障功能[7]，Podocin的缺乏可以激活TRPC6，从而导致裂孔隔膜功能失调[8]。本实验荧光结果显示，模型组大鼠肾脏组织中Nephrin与Podocin的荧光强度明显弱于正常组，证实膜性肾病时Nephrin与Podocin表达减少，与文献[2,9]报道一致。Verma等[10]研究报道，Nnephrin和Podocin表达减少，消弱了足细胞受伤后的恢复能力，足细胞密度下降，易于相互脱离，本实验中模型组大鼠电镜下可见足细胞广泛融合，与该研究结果相符。最近的证据表明，在各类蛋白尿性肾病中内吞作用增强[11-12]，其可快速下调细胞表面Nephrin表达，从而破坏裂孔隔膜完整性[13]。本研究中Nephrin的表达下降是否与内吞作用相关尚不清楚，有待研究。经贝那普利及健脾益肾活血方干预后，基底膜增厚及足突的融合在一定程度上减轻；Nephrin与Podocin表达平均荧光强度明显高于模型组,且健脾益肾活血方明显高于贝那普利组。有研究证实，ACEI上调Nephrin、Podocin表达是通过调节TRPC6影响裂孔隔膜实现的[14-15]，健脾益肾活血方上调Nephrin、Podocin表达的机制是否与此有关有待进一步研究。

综上所述，健脾益肾活血方可以减少膜性肾病大鼠蛋白尿，能够上调肾脏组织中Nephrin、Podocin蛋白表达，减轻足细胞裂孔隔膜损伤，维持其结构和功能的稳定，从而起到保护肾脏功能的作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。