丹参川芎嗪注射液对阿尔茨海默症小鼠学习记忆能力及脑内炎性因子、Tau蛋白表达的影响

姜 冉,李慧明,李 赞,陈晓燕,丁嘉科,陈永衡

(长沙医学院，湖南 长沙 410219)

阿尔茨海默症(AD)是一种认知功能逐渐衰退的慢性神经退行性疾病。随着人口老龄化，预计30年后，全世界每85人中就有一人患该疾病，大约43%的AD患者需要高水平护理，这给社会带来了巨大的经济负担[1]，因此AD的防治研究具有重要意义。AD标志性病理学改变表现为β淀粉样蛋白聚集而成的老年斑、过度磷酸化的Tau蛋白异常聚集形成神经纤维缠结以及神经元和突触的减少甚至丢失[2]。AD发病机制尚未明确，已有研究显示慢性炎症影响AD病理的以上3个特征[3]。因此，神经炎症被认为是治疗AD的潜在靶点。许多中药具有多靶点抗炎、不良反应少、作用温和等特点，在预防和治疗AD中受到越来越多关注。丹参川芎嗪注射液是一种中药复方制剂，主要成分为盐酸川芎嗪和丹参素，常用于治疗脑梗死、脑出血、急性颅脑损伤、心绞痛等心脑血管疾病[4-6]，而且该药具有抗炎作用[7-8]，但其是否能通过抗炎作用发挥抗AD作用尚不清楚。本研究通过脑内注射Aβ25-35建立小鼠AD模型，观察了丹参川芎嗪注射液对AD小鼠学习及空间识别记忆的影响，并从脑内炎症因子和磷酸化Tau蛋白(p-Tau)堆积方面探讨了该药的作用机制，旨在为临床防治AD提供新的思路和方法。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级小鼠48只，雌雄各半，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(湘)2019-0014。小鼠均饲养于SPF级实验室，温度维持(22±3)℃，湿度维持于45%～65%，适应性饲养7 d。

1.2主要药物、器材和试剂 丹参川芎嗪注射液(贵州拜特制药有限公司，国药准字H52020959)；盐酸多奈哌齐(重庆植恩药业有限公司，国药准字H20010723)；脑立体定位仪；Morris 水迷宫；病理切片机。Aβ25-35购自美国Sigma公司；牛血清白蛋白(10735078001)购自Roche公司；DAB显色试剂盒(ZLI-9033)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；苏木素染液(AS1055A)、伊红染液(AS1094)、HRP标记兔抗山羊、HRP标记山羊抗兔、HRP标记山羊抗小鼠和HRP标记山羊抗大鼠购自Aspen公司；白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒购自上海丰翔生物科技有限公司；p-Tau抗体购自Affinity公司。

1.3实验方法 采用随机数字表将48只小鼠随机分为空白组、模型组、盐酸多奈哌齐组及丹参川芎嗪低、中、高剂量组，每组8只。小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪，沿颅骨中线剪开约1 cm，暴露前囟门。除空白组外，其余组小鼠参考文献[9]方法，于右侧海马CA1区(右脑室定位，以囟门为零点，后0.3 mm，矢状缝旁开1 mm，进针深度为颅骨下2.5 mm)注射2 μg/μL的Aβ25-353 μL建立AD模型，术后创面涂抹青霉素，小鼠单笼饲养。造模7 d后，参考文献[10]给药剂量，盐酸多奈哌齐组给予盐酸多奈哌齐1.3 mL/kg腹腔注射，丹参川芎嗪低、中、高剂量组分别给予丹参川芎嗪注射液0.7 mL/kg、1.3 mL/kg、2.6 mL/kg腹腔注射，空白组、模型组给予生理盐水腹腔注射，均1次/d，连续4周。

1.4观察指标及方法

1.4.1Morris水迷宫实验 干预结束后开始水迷宫实验，实验前于水中混入可食白色素，减少视觉干扰，在每次测试后清洗池侧壁以确保消除嗅觉提示。定向航行实验：将小鼠面向池壁从不同象限放入水中，记录小鼠在60 s内寻找到平台的时间，即为逃避潜伏期(若小鼠60 s内不能找到则由实验者用手牵引其到平台上停留10 s，再放回到笼中)，连续实验5 d。空间探索实验：定向航行实验结束24 h后撤去平台，测量小鼠对平台空间位置的准确记忆情况，记录各组小鼠目标象限停留时间、穿越平台区域次数。

1.4.2新物体识别实验 小鼠适应性饲养1 d后，参考文献[11],在小鼠完全自由的状态下进行实验：先进行训练，即在旷场内两个相邻对称处各放置1个完全相同的物体，记录5 min内小鼠嗅探2个物体的时间；训练结束1 h后进行测试，将训练时小鼠嗅探过的2个物体其中的1个用新物体取代，记录5 min内小鼠嗅探新物体和旧物体的时间。计算探索时间和偏爱指数。偏爱指数=嗅探新物体的时间/总嗅探时间×100%。

1.4.3脑组织HE染色病理观察 行为学测试完成后次日，采用4%水合氯醛麻醉小鼠，仰卧位固定，剪开皮肤及胸廓，暴露心脏，将100 mL生理盐水缓慢注入左心室，再用4%多聚甲醛灌注固定，断头分离出脑组织，用生理盐水清洗后放入4%多聚甲醛中固定。制备石蜡切片，常规HE染色，光学显微镜下观察海马组织结构，使用Image J软件对海马组织神经细胞计数。

1.4.4脑组织中IL-1β和TNF-α表达情况 每组随机取4只小鼠脑组织，使用匀浆器将其制成10%的脑组织匀浆，4 ℃下4 500 r/min离心(离心半径13.5 cm)10 min，收集上清液。使用ELISA法在连续光谱酶标仪上检测IL-1β、TNF-α表达量。

1.4.5脑组织中p-Tau蛋白免疫组化检测 取各组小鼠脑组织石蜡切片，脱蜡至水，置于EDTA缓冲液中微波修复，然后置于3%过氧化氢溶液中室温下避光孵育10 min，甩干后用5% BSA封闭20 min，加入稀释的p-Tau抗体50 μL覆盖组织，4 ℃过夜。加50～100 μL 相应种属的二抗，37 ℃孵育50 min；加新鲜配制的DAB溶液50～100 μL。各步骤间PBS洗涤3次，显色完全后，蒸馏水冲洗，苏木素复染，1%盐酸酒精分化约1 s，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。将胶片进行扫描存档，使用AlphaEase FC软件处理系统分析光密度值。

1.4.6脑组织中p-Tau蛋白Western blot检测 取各组小鼠脑组织，用预冷的PBS缓冲液漂洗2～3次后，剪成小块置于匀浆器中，加入10倍于组织体积的组织蛋白提取试剂冰浴匀浆。将匀浆液转移至离心管中振荡，冰浴30 min，期间用移液器反复吹打，使匀浆液完全裂解。4 ℃下12 000 r/min离心(离心半径5.9 cm)5 min，收集上清，使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。SDS-PAGE电泳，转膜，化学发光显影、定影。采用Image J软件处理系统分析蛋白条带，计算相对表达量。

2 结 果

2.1各组小鼠学习记忆能力比较 模型组小鼠定向航行实验第2～5天的逃避潜伏期均明显长于空白组(P均<0.05)，盐酸多奈哌齐组和丹参川芎嗪高剂量组均明显短于模型组(P均<0.05)。模型组小鼠空间探索实验穿越平台次数明显少于空白组(P<0.05)，目标象限停留时间明显短于空白组(P<0.05)；盐酸多奈哌齐组和丹参川芎嗪中、高剂量组穿越平台次数均明显多于模型组(P均<0.05)，目标象限停留时间均明显长于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组和阿尔茨海默症各组小鼠逃避潜伏期、穿越平台次数及目标象限停留时间比较

2.2各组小鼠识别记忆能力比较 模型组小鼠新物体识别实验中探索时间明显长于空白组(P<0.05)，盐酸多奈哌齐组和丹参川芎嗪中、高剂量组均明显短于模型组(P均<0.05)；模型组小鼠偏爱指数明显低于空白组(P<0.05)，盐酸多奈哌齐组和丹参川芎嗪中、高剂量组均明显高于模型组(P均<0.05);丹参川芎嗪高剂量组小鼠探索时间与偏爱指数与盐酸多奈哌齐组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 空白组和阿尔茨海默症各组小鼠新物体识别实验探索时间和偏爱指数比较

2.3各组小鼠脑组织HE染色病理学表现 与空白组比较，模型组小鼠海马区神经元细胞层次减少、排列紊乱、细胞固缩，神经元数量明显减少(P<0.05)；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组和丹参川芎嗪中、高剂量组细胞层次增多、排列整齐、胞体大、结构清晰，神经元数量明显多于模型组(P均<0.05)，丹参川芎嗪高剂量组神经元数量明显高于丹参川芎嗪中剂量组(P<0.05)，与盐酸多奈哌齐组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图1及图2。

2.4各组小鼠脑组织中IL-1β和TNF-α表达情况 模型组小鼠脑组织中IL-1β和TNF-α表达量均明显高于空白组(P均<0.05)；盐酸多奈哌齐组和丹参川芎嗪各组小鼠脑组织中IL-1β和TNF-α表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，丹参川芎嗪高剂量组均明显低于丹参川芎嗪低、中剂量组(P均<0.05),与盐酸多奈哌齐组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 空白组和阿尔茨海默症各组小鼠脑组织中IL-1β和TNF-α表达情况比较

2.5各组小鼠脑组织中p-Tau蛋白免疫组化检测表达情况 模型组小鼠脑组织中p-Tau蛋白表达IOD值明显高于空白组(P<0.05)；盐酸多奈哌齐组和丹参川芎嗪各组小鼠脑组织中p-Tau蛋白表达IOD值均明显低于模型组(P均<0.05)，且丹参川芎嗪各组呈剂量依赖性降低，两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3及图4。

2.6各组小鼠脑组织中p-Tau蛋白Western blot检测表达情况 模型组小鼠脑组织中p-Tau蛋白相对表达量明显高于模型组(P<0.05)；盐酸多奈哌齐组和丹参川芎嗪中、高剂量组小鼠脑组织中p-Tau蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，且丹参川芎嗪高剂量组明显低于丹参川芎嗪中剂量组(P<0.05)。见图5。

3 讨 论

AD的病因假说众多，但尚未有任何一种假说可全面解释此病。近年来，神经炎症在AD发病机制中的作用被许多研究者重视[3]。在AD的初始阶段，炎症因子对于脑部神经细胞有保护作用，但随着疾病进展，炎症因子持续作用和过度产生，导致神经元和突触的损伤凋亡[12]。

学习和记忆测试通常被用于评估动物的认知功能。Morris水迷宫实验是一种用来测定动物学习记忆能力的方法[13],新物体识别实验是用来测定动物物体识别记忆能力的方法，二者常用来评价动物药效。本实验结果显示，与空白组比较，模型组小鼠逃避潜伏期延长，目标象限停留时间缩短，穿越平台区域次数减少，偏爱指数明显下降，说明模型组小鼠学习记忆和物体识别能力下降，发生认知功能障碍，证实Aβ25-35可破坏小鼠的学习记忆能力，成功建立AD模型。与模型组比较，丹参川芎嗪高剂量组逃避潜伏期均明显缩短，穿越平台次数均明显增多，目标象限停留时间均明显延长，对新物体识别时间延长，偏爱指数明显升高，说明丹参川芎嗪注射液可以减轻AD小鼠的认知功能障碍，提高小鼠的学习记忆和物体识别能力。

目前研究发现，参与IL-1β合成的炎性酶caspase-1或nlrp3基因缺失，可提高AD小鼠小胶质细胞对Aβ的清除和认知能力[14]，IL-1β等炎性因子的产生可抑制小胶质细胞对Aβ的清除能力。Aβ可激活小胶质细胞，导致促炎因子的释放，这些因子诱导amyloid precursor protein (APP)产生，由于APP数量增加，导致Aβ产生增多，炎性因子与Aβ相互影响而促进AD的发展[15]。本实验结果显示，模型组脑组织中IL-1β、TNF-α表达量明显高于空白组，丹参川芎嗪中、高剂量组均明显低于模型组，推测丹参川芎嗪注射液可能通过抗炎作用抑制APP的产生，使Aβ生成减少，从而达到逆转Aβ所致学习记忆和物体识别能力的损伤。

炎症信号可调节突触修剪，过度的神经炎症会使突触修剪功能失调，导致突触相关蛋白丢失，从而损伤神经元[16]。本实验发现，小鼠海马区注射Aβ会导致神经元受损，神经元数量减少，而丹参川芎嗪中、高剂量组小鼠脑内神经元数量明显高于模型组，提示丹参川芎嗪注射液对于脑部神经元有一定的保护作用。脑部神经元上有许多炎症因子受体，导致炎症信号可直接激活神经蛋白激酶和磷酸酶，进而加剧Tau蛋白磷酸化，且炎症因子的刺激导致Aβ斑块周围活化的小胶质细胞数量增加，促进GSK3β和p38-MAPK的活化，导致Tau蛋白磷酸化水平升高[17]。本实验结果显示，模型组小鼠脑组织中p-Tau蛋白表达量明显高于空白组，丹参川芎嗪中、高剂量组均明显低于模型组。表明丹参川芎嗪注射液可以通过抑制炎症反应，减少Tau蛋白磷酸化，保护神经元。

综上所述，丹参川芎嗪注射液可能通过抑制炎性反应，减少Tau蛋白磷酸化而起到改善AD小鼠学习记忆和物体识别能力，减少神经元损伤作用，其具体作用机制还需进一步研究探讨。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。