基于网络药理学和分子对接预测雷公藤治疗肝炎的潜在机制

卫博文，张 玮，陈亚飞，王海燕，曹 丹，蒋杨雨，李 健

(北京中医药大学中医学院，北京 102488)

近年来，雷公藤防治各类肝脏病的药效及药理作用引起研究者的广泛重视。已有的基础和临床研究结果表明，雷公藤提取物和制剂对病毒性肝炎[1-3]、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[4]、免疫性肝炎[5-6]、糖尿病肝损伤[7]等均有很好的改善作用，但是相关分子药理机制尚未完全揭示。雷公藤制剂使用不当会出现毒副作用，影响肝、肾功能，是研究“药效/毒性”转化的理想药物，其相关物质基础、在靶和脱靶效应、分子药理和毒理机制的研究亟待深入开展。本课题组前期研究中，应用常规网络药理学方法探讨了雷公藤的药理、毒理作用及可能的作用机制[8]。然而，受数据库及网络药理学技术的限制，前期的研究缺乏具体指向性以及对特定靶标、通路的解析，获得的预测结果对药物研发及临床应用指导意义有限。为此，本研究以肝炎为研究体系，整合网络药理学和分子对接技术，构建雷公藤活性化合物与的肝炎靶点间的相互作用网络模型，预测雷公藤治疗各类肝炎的潜在药理机制，为中药新药的研发和药物安全使用提供理论依据。

1 方法及流程

1.1雷公藤活性成分及靶点搜集 以“雷公藤”为关键词，在TCMSP数据库(http://tcmspw.com/)中检索并筛选活性成分(OB≥30%及DL≥0.18)[9]，用Uniprot 数据库(http://www.uniprot.org/)对靶点名称进行校正。

1.2雷公藤活性成分-靶点网络的构建 将雷公藤活性成分、靶点等信息导入Cytoscape v3.7.2软件，构建“活性成分-靶点网络(drug-target network)”，做可视化处理及网络解析。以节点度(Degree)的大小表示可视化网络中该节点与其关联的节点之间相连线段的条目数，Degree值越大表示该节点在可视化网络中起到的作用越大，并用节点的重要程度进行雷公藤中的重要活性成分筛选。

1.3肝炎疾病靶点采集、筛选 以“Hepatitis”为关键词，在GeneCards(http://www.genecards.org/)、PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)和OMIM(https://omim.org/)数据库中搜索疾病靶点，经数据清洗、去重，通过Uniprot数据库标准化。

1.4雷公藤和肝炎共有靶点的筛选及网络构建 将雷公藤和肝炎的靶点提交至Jvenn网站(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)，筛选二者共有靶点，并使用韦恩图呈现。共有靶点信息上传至String数据库(https://string-db.org/)构建可视化PPI网络(Protein-Protein interaction network)，根据所得Degree值，应用R软件绘制直方图。进而，将共有靶点信息上传至DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，进行GO和KEGG富集分析，结果按P值升序排列(P≤0.05)，选出排序前10的生物过程、分子功能及细胞组分，提交至微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)做可视化处理，并应用Cytoscape构建雷公藤“药物-活性成分-靶点-通路-疾病”网络模型。

1.5分子对接 选取雷公藤活性成分-靶点网络中Degree前5名的化合物(山柰酚、雷公藤甲素、β-谷固醇、诺比列汀、豆甾醇)和PPI网络中Degree最高的8个靶点分子AKT1(PDBID:4EKL)、CXCL8(PDBID:4XDX)、JUN(PDBID:5FV8)、STAT3(PDBID:6NJS)、TNF(PDBID:5MU8)、TP53(PDBID:3Q05)、VEGFA(PDBID:4KZN)、PTGS2(PDBID:5F1A)，用PYMOL、AutoDockTools和AutoDock Vina软件进行分子对接处理。

2 结 果

2.1雷公藤和肝炎共有靶点网络 经TCMSP数据库检索，筛选出51个活性化合物，清洗后纳入28个组分及146个靶标分子。用Cytoscape 软件构建药物靶标网络(见图1)，发现了5个高连接区化合物，即山柰酚、雷公藤甲素、β-谷固醇、诺比列汀、豆甾醇。经检索Genecard、OMIM和PubMed数据库，获得肝炎相关分子(基因、蛋白)11 654个。将药物靶标和肝炎相关分子信息上传至Jvenn网站，获得二者共有靶点135个(见图2)，用String数据库绘制PPI网络(见图3)和Degree柱状图(见图4)。其中Degree≥60的节点包括：AKT1、TNF、TP53、VEGFA、JUN、CXCL8、STAT3、PTGS2。

2.2共有靶点富集分析 通过构建雷公藤的“药物-活性成分-靶点-通路-疾病”网络模型，直观地呈现了雷公藤的28种活性成分、135个共同靶点、20条信号通路和肝炎靶标间的关联模式，见图5。GO分析显示：雷公藤可能干预的生物过程涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、药物的反应(response to drug)、DNA模板转录正调控(positive regulation of transcription, DNA-templated)等，与之有关的细胞组分涉及有质膜(plasma membrane)、细胞核(nucleus)、细胞质(cytoplasm)等，相对应的分子功能有蛋白质结合(protein binding)、酶结合(enzyme binding)、蛋白质同源二聚体活性(protein homodimerization activity)等(见图6)。经KEGG富集分析，前20个关键信号通路涉及代谢、凋亡、炎症等相关信号通路，包括：PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)和Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)等(见图7)。

2.3分子对接结果 AKT1与诺比列汀和雷公藤甲素，CXCL8与β-谷固醇和豆甾醇，PTGS2与山柰酚具有强相互作用(见表1)。如图8所示，氨基酸残基Asp439、Glu234与诺比列汀形成氢键相互作用，氨基酸残基Tyr437、Phe438、Phe442、Leu156、Gly157、Val164、Ala177、Lys179、Met227、Asp292、Thr291、Glu278、Met281与诺比列汀形成疏水相互作用。如图9所示，A氨基酸残基Asp292与雷公藤甲素形成氢键相互作用，氨基酸残基Thr291、Met281、Phe438、Leu156、Val164、Lys179、Gly159、Thr160与雷公藤甲素形成疏水相互作用。如图10所示，氨基酸残基Phe65、Leu25、Ile39、Ile28、Lys3与β-谷固醇形成疏水相互作用。如图11所示，氨基酸残基Ala69、Phe65、Leu25、Val27与豆甾醇形成疏水相互作用；如图12所示，氨基酸残基Ala199、His207、Tyr385与山柰酚形成氢键相互作用，氨基酸残Leu391、Leu390、His386、Asn382、Phe210、Thr206、Ala202、Gln203与山柰酚形成疏水相互作用。

表1 对接得分表(kcal/mol)

3 讨 论

网络药理学是基于多向药理学、计算生物学、系统生物学及网络生物学等技术，利用多种数据分析工具，构建“药物-靶点-疾病”关系网络，解析药物与疾病间关系的一门融合类交叉学科[10]。网络药理学的研究策略对于解析中药多组分、多靶点、多功效的作用机制非常契合，其预测得到的药物靶点、通路等结果与“湿法”实验相结合，不仅能提高新药研发、药理机制解析的效率，而且能极大地节约研究成本[11-13]。

在课题组前期实验研究的基础上，本研究进一步解析了雷公藤中山柰酚、雷公藤甲素、β-谷甾醇、诺比列汀、豆甾醇等化合物可能的作用机制，即通过AKT1、TNF、TP53、VEGFA等靶点以及调节PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路等发挥肝炎的治疗作用。已有的文献表明，山柰酚是一种类黄酮，具有治疗炎性疾病的潜力[14]，可以通过抑制IL-4[15]、CRP、COX-2等的表达以及下调肝细胞中NF-κB的含量而表现出抗炎作用[16]。雷公藤甲素具有抗癌[17]、免疫抑制和抗炎[18]等药理活性，可以调节促炎细胞因子和趋化因子如IFN-γ[19]、IL-8[20]、COX-2和NO[21]等来抑制炎症并增强细胞的保护作用。雷公藤甲素还通过参与调节活性氧簇(ROS)和一氧化氮(NO)[22]，调控组蛋白甲基转移酶相关信号通路，从而诱导细胞凋亡，触发自噬[23]并阻止细胞周期进程[24]。β-谷甾醇具有抗高脂血症、抗炎和抗肿瘤作用，同时还可以预防非酒精性脂肪肝疾病。此外，有研究表明，β-谷甾醇在脂多糖激活的J774A.1巨噬细胞中显示较好的抗炎作用，能显著抑制NF-κB的激活，抑制COX-2及CSF-1的表达，从而抑制炎症反应[25-26]。诺比列汀具有抗氧化、抗炎[27-28]活性，可以调节SIRT-1/FOXO3a介导的自噬和SIRT-1/PGC-1α介导的线粒体机制，诱导线粒体自噬，从而保护肝脏免受缺血/再灌注引发的损伤[29]。豆甾醇则具有良好的免疫调节功能，其抗炎及治疗关节炎的作用已被证明[30-31]。

本研究结果提示，AKT1、CXCL8和PTGS2可能成为雷公藤的潜在作用靶标。其中AKT1是PI3K信号通路中的关键分子，参与调节许多生物过程，包括物质代谢、细胞增殖和血管生成[32]。有证据表明AKT1参与急性炎症反应的发生、发展和血管通透性的急性改变[33]。CXCL8又称IL-8，是在炎症微环境中产生的CXC型趋化因子，在肿瘤发生发展中CXCL8信号失调，加剧肿瘤微环境的炎症状态，从而帮助癌细胞从原发部位向外周迁移[34-35]。PTGS2可引起炎症和氧化应激损伤，参与前列腺素合成的PTGS2可以在多种肝脏病理组织中检测到[36]。已有的研究提示，肝细胞内PTGS2的过表达可抑制促炎细胞因子，增加抗凋亡作用，并通过激活AKT和AMPK信号抑制肝组织炎症反应[37-39]。

借助GO富集分析及KEGG功能分析，AKT1、CXCL8和PTGS2与PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路和Toll样受体信号通路等相关。其中，PI3K-Akt信号传导途径在许多细胞过程(包括RNA加工、翻译和凋亡)中起着至关重要的调节作用，而与PI3K或AKT亚型拮抗的化合物则有望成为调节炎症和自身免疫性疾病的药物靶标[40]。TNF信号通路可以介导炎症反应，同时能够调节转录因子(c-fos、c-jun)的mRNA表达和炎症细胞因子的水平等[41]。Toll样受体(TLR)是膜结合受体，哺乳动物Toll样受体在固有免疫细胞上表达，Toll样受体信号通路可以识别病原体，快速激活固有免疫，诱导机体产生促炎细胞因子和上调共刺激分子，导致多种炎症基因表达[42]。

本研究应用分子对接技术初步验证了雷公藤中5种主要活性成分与肝炎关键靶点蛋白具有较好的亲和力，进而提示：从雷公藤中有望发现并开发出防治各类肝炎的新药，其潜在靶标及其相关信号通路为进一步解析雷公藤的分子药理机制提供了明确研究方向。目前，本课题组正在依托细胞实验，通过敲低(knock down)和过表达AKT1、CXCL8和PTGS2基因，对雷公藤的分子药理机制进行实验验证，以期产出一系列原创性成果。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。