基于穴位电刺激对神经病理性疼痛大鼠p38MAPK影响探讨穴位镇痛机制

杨代和，魏 真，林永宝，黄 文，龙 波，张孟丽，蔡 楠，李 洁

(1. 福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003；2. 安溪县医院，福建 安溪 362499；3. 漳州市第三医院，福建 漳州 363007)

穴位电刺激是在针刺刺激穴位的基础上，通过脉冲电流以增强疗效的针灸疗法，该方法可提高神经病理性疼痛阈值[1]。p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)是细胞内外信号重要传递者，p38MAPK在神经病理性疼痛中发挥着重要作用[2]。本项目立足于前期实验及理论研究，观察了穴位电刺激足三里、夹脊穴对坐骨神经慢性压迫模型大鼠神经病理性疼痛的镇痛作用及对背根神经节中p38MAPK信号转导途径的影响，旨在进一步探讨穴位电刺激镇痛的具体机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康雄性8周龄SD大鼠125只，体重200～250 g，由福建中医药研究院实验动物中心提供，许可证号：SYXK(闽)2016-0005。每笼养5只，室内保持通风，饲养环境温度为22～24 ℃，湿度50%～65%。

1.2实验方法 应用随机数字表将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、抑制剂组、针刺穴位组、电刺激穴位组，每组25只。抑制剂组于造模前24 h参照Poon等[3]方法鞘内置管：腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠，俯卧位固定，选取L3～4棘突间隙，备皮、消毒，切开皮肤，分离棘突间隙的肌肉和筋膜，暴露并穿破硬脊膜将PE-10导管(内径0.28 mm、外径0.64 mm，Smiths Medical International Ltd．英国)朝头端置入2 cm，当大鼠出现甩尾反射以及有脑脊液流出，提示置管成功，固定导管，导管通过皮下隧道从颈部引出。第2天采用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉各组大鼠，仰卧位固定，切开皮肤，假手术组分离肌肉筋膜，暴露坐骨神经后未进行结扎；其余组参考文献[4]建立神经病理性疼痛模型：钝性分离坐骨神经，4-0铬制羊肠线结扎，每两道间隔1 mm，结扎4道。术后缝合皮肤后预防感染，假手术组和模型组不给予其他处理；抑制剂组鞘内注射SB203580(购自美国Med Chem Express公司)2 g，2次/d，持续注射14 d；针刺穴位组采用28号1寸毫针(华佗牌，苏州医疗用品有限公司)针刺足三里及双侧L3～6夹脊穴，但不给予电刺激，2次/d，持续14 d；电刺激穴位组针刺方法同针刺穴位组，针刺后接LH-800型穴位神经刺激仪(北京航空航天大学)进行电刺激，连续波，频率2 Hz，强度1 mA，刺激30 min，2次/d，持续14 d。

1.3检测指标及方法

1.3.1行为学检测 分别于术前1 d及术后1 d、3 d、7 d、14 d当天8:00进行疼痛行为学检测，环境保持静音、恒温通风，避免对大鼠造成激惹，检测前先将大鼠放在检测环境中适应1 h，依次检测机械触诱发痛阈(MWT)和热缩足反射潜伏期(PTWL)，间隔时间为1 h。所有检测都由同一人完成。

1.3.1.1MWT检测方法 通过动态足底触觉仪进行测试，采用Chaplan等[5]改良的评估法评估。将大鼠置于透明隔笼中适应15 min，然后将von Frey细丝垂直刺激大鼠后脚掌中部皮肤，刺激力度(0.4 g、0.6 g、1.0 g、2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、15.0 g)从2.0 g开始，每次刺激持续6～8 s，根据大鼠的反应依次评估(up-down 法[6])，大鼠表现缩足或舔足反应则标记为阳性，无反应则标记为阴性，每只大鼠评估时间控制在1 min之内。当von Frey细丝刺激强度小于4 g即确认出现神经病理性疼痛。

1.3.1.2PTWL检测方法 采用热刺激痛觉测试仪检测，参考Hargreaves[7]的方法评估。评估前15 min大鼠先放在树脂玻璃笼中适应，每只评估3次，每次间隔3 min，取缩足反应平均值为热痛阈值，最长热刺激时间20 s。

1.3.2腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白表达检测 采用 Western blot法检测：分别于术前1 d及术后1 d、3 d、7 d、14 d，每组随机选取5只大鼠处死，取出其手术侧腰膨大匀浆，每个电泳道中加入30 μg总蛋白，用SDS-PAGE凝胶分离蛋白，转移到醋酸纤维素膜上，滤膜在室温下封阻1 h，在抗TNF-α抗体、抗p38MAPK抗体以及抗β-actin抗体中4 ℃孵育一夜，所得的印迹通过二抗孵育1 h，放到ECL试剂盒中显影1 min，然后于X射线片上暴露1～10 min，p38MAPK和TNF-α的数据分别与各自的β-actin在同一张滤膜上进行内对照。

1.4统计学方法 数据采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，计量资料均呈正态分布，组内比较用重复测量资料的方差分析，组间比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠MWL和PTWL比较 假手术组大鼠各时间点的MWL、PTWL比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。与术前1 d比较，模型组、抑制剂组、针刺穴位组、电刺激穴位组术后各时间点的MWL均明显降低(P均<0.05)，PTWL均明显缩短(P均<0.05)，且术后3 d时MWL最低、PTWL最短。术后1 d、3 d时与抑制剂组比较,模型组、针刺穴位组、电刺激穴位组的MWL更低，PTWL更短,差异均有统计学意义(P均<0.05)。术后3 d、7 d、14 d时与模型组比较,针刺穴位组、电刺激穴位组的MWL更高，PTWL更长,差异均有统计学意义(P均<0.05)。术后7 d、14 d时与针刺穴位组比较，电刺激穴位组的MWL更高，PTWL更长，差异均有统计学意义(P均<0.05)。术后7 d、14 d时,抑制剂组和电刺激穴位组的MWL、PTWL比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1和图2。

2.2各组大鼠腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白表达情况比较 假手术组大鼠各时间点腰膨大中TNF-α、p38MAPK蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。与术前1 d比较，模型组、抑制剂组、针刺穴位组、电刺激穴位组术后各时间点腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白相对表达量均明显增高(P均<0.05)，且术后3 d时最高。术后1 d、3 d时，抑制剂组腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白相对表达量均明显低于模型组、针刺穴位组、电刺激穴位组(P均<0.05)。术后3 d、7 d、14 d时，针刺穴位组、电刺激穴位组腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白相对表达量明显低于模型组(P均<0.05)。术后7 d、14 d时，电刺激穴位组腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白相对表达量明显低于针刺穴位组(P均<0.05)。术后7 d、14 d时,抑制剂组和电刺激穴位组腰膨大中TNF-α、p38MAPK蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3和图4。

3 讨 论

大鼠坐骨神经慢性压迫模型引起坐骨神经痛觉超敏类似于神经病理性疼痛患者的症状，中枢和外周敏化都是神经病理性疼痛的病理因素[8]。脊髓背角神经元突触可塑性的改变形成突触长时程增强，同脊髓背角神经元的中枢敏化以及神经病理性疼痛的产生有着密切关系。损伤的外周感觉神经元激活小胶质细胞释放细胞因子，引起兴奋性氨基酸释放增多，尤其是谷氨酸的释放，谷氨酸与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体结合后，细胞膜对钾离子、钠离子的通透性增强，引起突触后膜电位，当去极化到达一定程度时，则钙离子通道开放，内流的Ca2+与钙调蛋白(CaM)结合形成Ca2+/CaM/复合物，激活一氧化氮合酶(NOS)，催化一氧化氮(NO)生成[9]。NO是一种神经信号传递因子，经过级联反应促使信息放大，引发中枢敏化[9]。周围神经损伤通过脊髓背角、丘脑等神经通路，激发大脑皮质产生痛觉[10]。

针刺是中国的传统疗法，穴位电刺激是在针刺基础上发展而来。足三里、夹脊穴是治疗下肢慢性疼痛的有效穴位，电针上述穴位可改善局部血液循环，抑制炎症反应和渗出，有效减轻急慢性疼痛，改善神经病理性疼痛症状。Liang等[11]研究发现穴位电刺激能有效抑制神经病理性疼痛大鼠腰段脊髓背角小胶质细胞的活化，具有很好的即刻镇痛作用和后效应。马骋等[12]通过坐骨神经损伤大鼠模型研究发现，穴位电刺激可以抑制C纤维诱发电位突触长时程传递的形成，阻断突触可塑性的形成，降低脊髓背角神经元的敏感性。本实验结果显示，坐骨神经慢性压迫模型大鼠伤后1 d出现机械触诱发痛阈和热痛觉阈值下降，伤后3 d达到最低值，与Wu等[13]报道的结果一致。术后3 d、7 d、14 d时，针刺穴位组、电刺激穴位组的MWL明显高于模型组，PTWL明显长于模型组；术后7 d、14 d时，电刺激穴位组的MWL明显高于针刺穴位组，PTWL明显长于针刺穴位组。提示针刺足三里及双侧L3～6夹脊穴可以改善坐骨神经慢性压迫模型大鼠机械触诱发痛阈和热痛觉阈值下降，穴位电刺激比常规针刺效果好。

p38 MAPK是MAPK家族成员之一，同应激、炎症反应等密切相关，脊髓背角小胶质细胞的p38MAPK蛋白磷酸化导致神经病理性疼痛[14-15]。陆培春等[16]研究认为大鼠坐骨神经损伤导致腰段脊髓背角TNF-α等炎症因子升高。TNF-α可激发蛋白激酶级联反应，促使p38MAPK磷酸化为p-p38MAPK，p-p38MAPK进入到其他部位或细胞胞核中，调节细胞转录、受体表达以及蛋白合成等过程，对机体疼痛信号的传递发挥重要作用[17]。SB203580是p-p38MAPK抑制剂，可以阻断坐骨神经慢性压迫模型大鼠脊髓背角小胶质细胞释放TNF-α，并可明显抑制p-p38MAPK表达和磷酸化[18]。本实验结果显示，坐骨神经慢性压迫模型大鼠伤后1 d腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白表达量明显升高，3 d达到最高值，与杨亮等[19]研究一致，提示TNF-α与p38之间可能存在着重要联系，且在神经损伤后的神经病理性疼痛形成过程中发挥重要作用。术后3 d、7 d、14 d时，抑制剂组、针刺穴位组、电刺激穴位组腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白相对表达量均明显低于模型组；术后7 d、14 d时，电刺激穴位组腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白相对表达量明显低于针刺穴位组，与抑制剂组比较差异均无统计学意义。提示针刺足三里及双侧L3～6夹脊穴可以抑制坐骨神经慢性压迫模型大鼠腰膨大中TNF-α和p38MAPK蛋白表达，但穴位电刺激效果更好。

综上所述，穴位电刺激治疗与常规针刺治疗相比，可更及时、有效地缓解神经病理性疼痛；穴位电刺激的镇痛作用可能是通过调节L3～6脊髓背角p38MAPK受体的表达从而影响TNF-α合成来实现的。今后可用基因敲除手段等进一步研究p38MAPK受体与穴位电刺激镇痛的关系。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。