利拉鲁肽调控miR-15b-5p对高糖诱导的足细胞炎性反应和免疫功能的影响

高卫华 周学锋 宋炜 宋梦

糖尿病肾病作为肾内科常见的系统疾病，多发于糖尿病患者，主要受遗传、高血糖造成的代谢异常等影响，是导致终末期肾脏病的主要原因[1,2]。由于糖尿病肾病的发病机制较为复杂，且当前以控制血糖及血压、饮食等综合治疗为主，因此，有效治疗方式是当前医学的重点难点[3]。氧化应激、炎性反应等因素与糖尿病肾病的发病密切相关，炎性反与免疫系统激活在糖尿病肾病发病机制中相互影响，并促进糖尿病肾病的发生和发展[4]。利拉鲁肽在抑制胰高血糖素分泌方面具有重要的作用，广泛用于治疗2型糖尿病[5]，有研究发现，利拉鲁肽可以抑制糖尿病肾病患者的氧化应激和炎性反应，改善胰岛素的分泌[6]。杨青平等[7]研究显示，利拉鲁肽可以减缓高糖诱导的足细胞损伤，起作用机制可能与下调Grem1 mRNA，上调Nephrin表达有关。miRNA在糖尿病肾病研究密切相关，如miR-15b-5p在高糖诱导的足细胞中表达下调，过表达miR-15b-5p可以减缓高糖诱导足细胞凋亡、氧化应激和炎性反应[8]。本研究通过体外培养足细胞MPC-5，探讨利拉鲁肽是否可以调控miR-15b-5p的表达影响高糖诱导足细胞的氧化应激、炎性反应和免疫功能。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 小鼠肾足细胞MPC-5购买于武汉华联生物公司；胎牛血清、RPMI-1640培养基购买于美国Gibco公司；γ干扰素、葡萄糖购买于美国sigma公司；利拉鲁肽注射液购买于中国诺和诺德制药公司，国药准字：J20160037，规格：3 ml/18 mg；anti-miR-NC、anti-miR-15b-5p购买于广州锐博公司；LipofectamineTM2000试剂盒、RNA提取试剂盒购买于美国Invitrogen公司；MTT试剂盒购买于北京索莱宝公司；SOD试剂盒、MDA试剂盒购买于上海碧云天公司；TNF-α试剂盒、IL-6试剂盒、IL-1β试剂盒购买于南京建成生物研究中心；TGF-β1抗体、IL-2抗体、GAPDH抗体购买于英国Abcam公司；HRP标记的IgG购买于武汉博士德公司；逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒购买于日本TaKaRa公司，引物购买于上海吉玛公司。

1.2 细胞培养 从超低温冰箱内取出MPC-5细胞，复苏培养在含有10%胎牛血清、γ干扰素(150 U/ml)的RPMI-1640培养液内，在条件为33℃、5% CO2培养箱内进行增殖培养。观察细胞的生长状态，待细胞融合至85%时，更换培养基且不含γ干扰素，在条件为37℃、5% CO2培养箱内进行孵育培养14 d。

1.3 细胞分组 实验开始前24 h更换培养基(不含γ干扰素)，收集生长状态良好的MPC-5细胞，调整密度后接种在96孔板内，选择5 mmol/L和30 mmol/L的葡萄糖处理细胞，记为对照(Con)组和高糖(HG)组；选择利拉鲁肽(Liraglutide)浓度10、50、100 nmol/L后加入30 mmol/L的葡萄糖处理细胞，记为利拉鲁肽低、中、高剂量(HG+LIR-L、HG+LIR-M、HG+LIR-H)组。选择100 nmol/L的利拉鲁肽和30 mmol/L的葡萄糖处理细胞，记为高糖+利拉鲁肽(HG+LIR)组；将anti-miR-NC、anti-miR-15b-5p按照LipofectamineTM2000试剂盒转染至MPC-5细胞，然后经过100 nmol/L的利拉鲁肽和30 mmol/L的葡萄糖处理，记为高糖+利拉鲁肽+anti-miR-NC、高糖+利拉鲁肽+anti-miR-15b-5p(HG+LIR+anti-miR-NC、HG+LIR+anti-miR-15b-5p)组。

1.4 MTT检测细胞活力 收集1.3各组MPC-5细胞，经过胰酶消化培养后，接种至96孔细胞板内，培养箱内孵育培养48 h，在每孔内加入5 mg/ml (20 μl)的MTT溶液，轻轻混匀后继续培养4 h。离心后再细胞的上清液内加入150 μl的DMSO溶液，在酶标仪540 nm 波长处检测各组细胞的OD值，计算细胞活力。

1.5 ELISA检测SOD、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达 收集1.3各组MPC-5细胞，轻轻消化吹打后，在离心机上800 r/min离心10 min，然后继续吹打破碎细胞，离心后收集上清液，通过检测试剂盒说明书检测SOD、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。

1.6 Western blot检测TGF-β1和IL-2蛋白表达 收集1.3各组MPC-5细胞，加入RIPA裂解液冰上裂解5 min，12 000×g离心15 min收集上清，经过SDS-PAGE凝胶处理后转移至PVDF膜上，加入50 g/L脱脂牛奶封闭培养1.5 h，加入TGF-β1 (1∶800)、IL-2 (1∶800)和GAPDH抗体(1∶1 000)，4℃孵育，次日加入HRP标记的山羊抗兔IgG (15 000)室温下培养1.5 h，在暗室内滴加电化学发光液显影。经过Image J软件读取蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，分析目的蛋白表达。

1.7 qRT-PCR检测miR-15b-5p的表达 收集1.3各组MPC-5细胞参照RNA提取试剂盒提取各组细胞的总RNA，取5 μg总RNA按照逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，按照荧光定量试剂盒配置反应体系，进行PCR扩增。以U6作为内参，采用2-△△Ct法计算miR-15b-5p的表达。miR-15b-5p正向引物为：5’-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3’，反向引物为：5’-TGCTTAGCAGCACATCATG-3’；U6正向引物为：5’-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物为：5’-GAGGTATTCGCACCAGAGGA-3’。

2 结果

2.1 利拉鲁肽对MPC-5细胞氧化应激和炎性反应的影响 与Con组相比，HG组的细胞活力、SOD活性显著降低(P<0.05)，MDA含量、TNF-α、IL-6、IL-1β表达显著增加(P<0.05)；与HG组相比，HG+LIR-L组、HG+LIR-M组、HG+LIR-H组的细胞活力、SOD活性显著增加(P<0.05)，MDA含量、TNF-α、IL-6、IL-1β表达显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 利拉鲁肽对MPC-5细胞氧化应激和炎性反应的影响

2.2 利拉鲁肽对MPC-5细胞免疫因子的影响 与Con组相比，HG组的TGF-β1、IL-2蛋白表达显著增加(P<0.05)；与HG组相比，HG+LIR-L组、HG+LIR-M组、HG+LIR-H组的TGF-β1、IL-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图1，表2。

图1 利拉鲁肽对MPC-5细胞免疫因子的影响

表2 利拉鲁肽对MPC-5细胞免疫因子的影响

2.3 利拉鲁肽处理MPC-5细胞后miR-15b-5p表达 与Con组相比，HG组的miR-15b-5p表达显著降低(P<0.05)；与HG组相比，HG+LIR-L组、HG+LIR-M组、HG+LIR-H组的miR-15b-5p表达显著增加(P<0.05)。见表3。

表3 利拉鲁肽处理MPC-5细胞后miR-15b-5p表达

2.4 利拉鲁肽通过miR-15b-5p表达对MPC-5细胞氧化应激和炎性反应的影响 与HG组相比，HG+LIR组的miR-15b-5p表达、细胞活力、SOD活性显著增加(P<0.05)，MDA含量、TNF-α、IL-6、IL-1β表达显著降低(P<0.05)；与HG+LIR+anti-miR-NC组相比，HG+LIR+anti-miR-15b-5p的miR-15b-5p表达、细胞活力、SOD活性显著降低(P<0.05)，MDA含量、TNF-α、IL-6、IL-1β表达显著增加(P<0.05)。见表4。

表4 利拉鲁肽通过miR-15b-5p表达对MPC-5细胞氧化应激和炎性反应的影响

2.5 利拉鲁肽通过miR-15b-5p表达对MPC-5细胞免疫因子的影响 与HG组相比，HG+LIR组的TGF-β1、IL-2蛋白表达显著降低(P<0.05)；与HG+LIR+anti-miR-NC组相比，HG+LIR+anti-miR-15b-5p组TGF-β1、IL-2蛋白表达增加(P<0.05)。见图2，表5。

表5 利拉鲁肽通过miR-15b-5p表达对MPC-5细胞免疫因子的影响

图2 利拉鲁肽通过miR-15b-5p表达对MPC-5细胞免疫因子的影响

3 讨论

在糖尿病患者早期肾体积异常增加，使肾小球滤过率增加，随着病程时间的增长，出现持续性蛋白尿、肾小球滤过率降低等情况，进而引发为糖尿病肾病，也是糖尿病患者死亡率较高的原因之一[9]。足细胞在维持肾小球结构和过滤屏障上具有重要作用，高糖诱导的足细胞炎性损伤是糖尿病肾病的关键环节[10]。本研究通过高糖诱导足细胞结果发现，高糖条件下细胞活力、SOD活性降低，MDA含量、TNF-α、IL-6、IL-1β表达增加，TGF-β1蛋白表达、IL-2蛋白表达上调。利拉鲁肽是新开发研究的胰高血糖素GLP-1类似物，具有降血糖和保护胰岛素β细胞等作用；在治疗2型糖尿病取得了一定的作用效果[11]。李婷等[12]研究显示，利拉鲁肽可以降低高糖诱导的肾小管上皮细胞的凋亡，促进细胞的活力，浓度越高且作用效果越明显。王海芳等[13]研究显示，利拉鲁肽通过抑制HSP70-TLR4轴减缓高糖诱导的糖尿病肾病小鼠的肾小管炎性损伤。TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-2是一种多效细胞的促炎性因子，在细胞生长和免疫抑制中具有重要的作用，TGF-β1在TGF-β家族中含量最高，在肾小管、肾小球和肾间质中广泛存在，具有细胞免疫逃避的作用，增强机体的炎性反应[14]。本研究结果显示利拉鲁肽各剂量组可以明显促进细胞活力、SOD活性，抑制MDA含量、TNF-α、IL-6、IL-1β表达，TGF-β1蛋白表达、IL-2蛋白表达下调，这说明利拉鲁肽可以抑制MPC-5细胞的氧化应激、炎性反应和免疫功能。

有研显示，miRNA与糖尿病肾病足细胞损伤、纤维化等密切相关，miRNA可以通过转录后调控基因的表达参与细胞的生长、氧化应激、炎性反应和细胞免疫等[15]。汤夏莲等[16]研究显示，高糖条件下miR-148b表达上调，抑制miR-148b可以减缓高糖诱导肾小球系膜细胞的活力，促进细胞凋亡和免疫抑制因子TGF-β1表达。苏征佳等[17]研究显示，miRNA-146b-3p在高糖诱导的内皮细胞中表达下调，利拉鲁肽通过抑制miRNA-146b-3p改善内皮细胞的炎性反应。Su等[18]研究显示，miR-218在高糖诱导的肾小管细胞中表达上调，miR-218通过下调GPRC5A减轻高糖诱导的肾小管细胞的凋亡、炎性反应。miR-485在高糖诱导肾小球膜细胞中表达下调，miR-485通过负调控NOX5促进高糖诱导肾小球膜细胞的增殖，抑制细胞的炎性反应[19]。本研究显示，高糖诱导MPC-5细胞后，miR-148b表达下调，经过利拉鲁肽处理后，miR-148b表达上调；利用敲低干扰技术，发现抑制miR-148b可以逆转利拉鲁肽对高糖诱导足细胞活力、氧化应激、炎性反应和免疫因子的作用，说明拉鲁肽通过miR-15b-5p表达发挥在糖尿病肾病中的作用。

综上所述，利拉鲁肽通过下调miR-15b-5p表达减缓高糖诱导的足细胞氧化应激、炎性反应和免疫功能，旨在为糖尿病肾病的研究提供合理的支撑。