lncRNA XIST靶向miR-30b-5p调控高糖条件下肾小管上皮细胞损伤的机制

王婷 刘宗明

(十堰市人民医院 1富康社区医院糖尿病科，湖北 十堰 442000；2内分泌科)

目前糖尿病的各种并发症是导致糖尿病患者死亡的主要原因，而糖尿病肾病(DN)是糖尿病的微血管慢性并发症之一，其发病机制复杂仍未完全阐明可能与糖代谢紊乱、炎症反应等相关〔1〕。lncRNA可与miRNA、mRNA或蛋白质结合发挥转录后水平的调控，且lncRNA参与DN的发生发展，可作为其诊断和预后的新型潜在生物标志物〔2〕。如LncRNA MALAT1在DN中表达失调，并通过与β-连环蛋白的相互作用参与高葡萄糖诱导的足细胞损伤〔3〕；LncRNA ENSMUST00000147869保护肾小球系膜细胞免受DN诱导的增殖和纤维化〔4〕；而尚未见lncRNA X染色体失活特异性转录本基因(lncRNA XIST)在DN中的相关研究。研究表明miRNA在DN的发生及发展过程中起重要作用〔5〕。miR-30b-5p在小鼠DN模型中下调表达，过表达调控高糖诱导HK2细胞上皮间充质转化(EMT)〔6〕。但miR-30b-5p在DN中的作用机制尚不清楚，本文旨在研究lncRNA XIST在高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤中的表达及其对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的作用，且lncRNA XIST是否通过靶向调控miR-30b-5p的表达影响高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 肾小管上皮细胞HK-2购自中国科学院上海细胞库。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自日本Takara公司；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自上海联科生物技术有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；蛋白提取试剂盒、凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组 肾小管上皮细胞HK-2常规培养于RPMI1640培养基，取对数生长期细胞消化后，接种于96孔板(1×104个/孔)培养，培养24 h后吸取原培养液，分别换成5.5 mmol/L(对照组)和25.0 mmol/L(高糖组)葡萄糖的培养液继续培养48 h后收集备用。转染组：取对数生长期HK-2细胞，用无血清培养基同步化12 h；将si-NC、si-XIST、miR-NC、miR-30b-5p、si-XIST+anti-miR-NC、si-XIST+anti-miR-30b-5p转染至HK-2细胞培养24 h，后用25.0 mmol/L的葡萄糖培养液刺激培养48 h ，分别记为高糖+si-NC组、高糖+si-XIST组、高糖+miR-NC组、高糖+anti-miR-NC组、高糖+miR-30b-5p组高糖+si-XIST+anti-miR-NC组、高糖+si-XIST+anti-miR-30b-5p组。

1.2.2qRT-PCR分析miR-30b-5p及XIST mRNA表达水平 用Trizol提取总RNA，逆转录cDNA，按照荧光定量试剂盒说明书进行qRT-PCR扩增，相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.2.3Western印迹检测蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，上样60 μg后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5 %脱脂牛奶室温封闭90 min，分别加入相应的一抗，4 ℃孵育过夜；再加入相对应的二抗室温孵育2 h，暗室曝光显影、定影，分析蛋白条带吸光度，计算蛋白表达水平。

1.2.4ELISA检测肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6的表达 取各组细胞上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡 离心收集细胞，用结合缓冲液重悬细胞，然后加入膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)，避光孵育15 min；上流式细胞仪检测。

1.2.6双荧光素酶报告基因实验 构建XIST 3′UTR野生型和突变型荧光素酶表达载体(WT-XIST和MUT-XIST)，将其分别与miR-NC和miR-30b-5p共转染至HK-2细胞，依据说明书要求检测，以荧光素酶活性和Renilla活性的比值作为细胞荧光素酶相对活性。将pcDNA、pcDNA-XIST、si-NC、si-XIST转染至HK-2细胞，qRT-PCR分析miR-30b-5p表达水平。

1.3统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1高糖对肾小管上皮细胞HK-2中lncRNA XIST和miR-30b-5p表达的影响 相较于对照组，高糖组肾小管上皮细胞HK-2中miR-30b-5p表达水平显著降低，XIST mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 高糖对肾小管上皮细胞HK-2中lncRNA XIST和miR-30b-5p表达的影响

2.2下调XIST表达对高糖诱导的HK-2细胞炎症因子表达的影响 相较于对照组，高糖组肾小管上皮细胞HK-2中XIST mRNA的表达水平显著升高，相较于高糖+si-NC组，高糖+si-XIST组肾小管上皮细胞HK-2中XIST mRNA的表达水平显著降低(均P<0.05)。相较于对照组，高糖组肾小管上皮细胞HK-2中IL-6、TNF-α的表达水平显著升高，相较于高糖+si-NC组，高糖+si-XIST组肾小管上皮细胞HK-2中IL-6、TNF-α的表达水平显著降低(均P<0.05)。见表2。可见，下调XIST表达抑制高糖诱导的HK-2细胞炎症因子的表达。

表2 下调XIST表达对高糖诱导的HK-2细胞炎症因子表达的影响

2.3下调XIST表达对高糖诱导的HK-2细胞凋亡的影响 相较于对照组，高糖组Bax表达水平显著升高，而Bcl-2表达水平显著降低；相较于高糖+si-NC组，高糖+si-XIST组Bax表达水平显著降低，而Bcl-2表达水平显著升高(均P<0.05)。相较于对照组，高糖组HK-2细胞凋亡率显著升高，相较于高糖+si-NC组，高糖+si-XIST组HK-2细胞凋亡率显著降低(均P<0.05)。见图1、图2、表3。可见下调XIST表达抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡。

1～4:对照组，高糖组，高糖+si-NC组,高糖+si-NC组图1 Western印迹检测凋亡相关蛋白的表达

图2 下调XIST对高糖诱导的HK-2细胞凋亡的影响

表3 下调XIST对高糖诱导的HK-2细胞凋亡的影响

2.4miR-30b-5p过表达对高糖诱导的HK-2细胞损伤的影响 相较于高糖+miR-NC组，高糖+miR-30b-5p组Bax表达水平显著降低，Bcl-2表达水平显著升高(均P<0.05)；miR-30b-5p的表达水平显著升高(P<0.05)；IL-6、TNF-α的表达水平显著降低(P<0.05)；凋亡率显著降低(P<0.05)。见表4，图3。可见miR-30b-5p过表达抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡和炎症因子的释放，改善高糖诱导的细胞损伤。

表4 miR-30b-5p过表达对高糖诱导的HK-2细胞损伤的影响

图3 Western印迹检测各组Bcl-2、Bax的表达

2.5lncRNA XIST靶向调控miR-30b-5p的表达 TargetScan预测到XIST与miR-30b-5p存在结合位点，见图4。miR-30b-5p与WT-XIST共转染后HK-2细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；而miR-30b-5p与MUT-XIST共转染后HK-2细胞的荧光素酶活性差异不显著。见表5。相较于pcDNA组miR-30b-5p水平(1.02±0.09)，pcDNA-XIST组显著降低(P<0.05)；而相较于si-NC组miR-30b-5p水平(1.01±0.08)，si-XIST组(2.76±0.27)显著升高(P<0.05)。可见XIST靶向调控miR-30b-5p的表达。

图4 XIST含有与miR-30b-5p互补的核苷酸序列

表5 双荧光素酶报告实验

2.6抑制miR-30b-5p表达逆转了下调XIST表达对高糖诱导的HK-2细胞损伤的作用 相较于高糖+si-XIST+anti-miR-NC组，高糖+si-XIST+anti-miR-30b-5p组Bax表达水平显著升高，Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)；miR-30b-5p的表达水平显著降低(P<0.05)；IL-6、TNF-α的表达水平显著升高(P<0.05)；凋亡率显著升高(P<0.05)。见图5，表6。可见miR-30b-5p抑制表达逆转了下调XIST表达对高糖诱导的HK-2细胞凋亡和炎症因子的释放的抑制作用，逆转了下调XIST表达改善高糖诱导的细胞损伤。

1，2:高糖+si-XIST+anti-miR-NC组,高糖+si-XIST+anti-miR-30b-5p组图5 凋亡相关蛋白表达

表6 抑制miR-30b-5p表达逆转了下调XIST表达对高糖诱导的HK-2细胞损伤的作用

3 讨 论

DN是糖尿病最严重的并发症，其发病率逐年升高，已成为危害人类的重大疾病〔7〕。研究发现lncRNA和miRNA在DN中异常表达，参与了DN的发生及发展〔8〕。lncRNA XIST是一种表观遗传调节因子，已发现其在多种癌症中表达失调，XIST沉默通过调节miR-320/NOD2对氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞损伤发挥保护作用〔9〕。lncRNA XIST在脊髓损伤小鼠脊髓组织中的表达显著上调，抑制XIST表达可通过PI3K/AKT信号通路的再激活来抑制细胞凋亡而保护脊髓损伤〔10〕。XIST在心肌梗死后的心肌细胞中过表达，通过靶向miR-130a-3p调节心肌梗死〔11〕。lncRNA XIST可通过miR-211/CXCR4轴促进骨关节炎软骨细胞的增殖并促进细胞凋亡〔12〕。敲除LncRNA-XIST通过Notch-1途径抑制非小细胞肺癌中的增殖和转化生长因子(TGF)-β1诱导的EMT〔13〕。本研究结果表明lncRNA XIST在高糖诱导的肾小管上皮细胞中表达升高，下调XIST表达可抑制细胞凋亡，保护高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤。且lncRNA XIST靶向调控miR-30b-5p的表达。

研究发现miR-30c-5p通过靶向SOCS3稳定缺氧诱导因子1α表达可改善缺氧/复氧诱导的肾小管上皮细胞损伤〔14〕。miR-30b-5p在肾细胞癌组织和细胞系均低表达，过表达可抑制肾细胞癌细胞系的增殖、侵袭、迁移和EMT〔15〕。缺血再灌注诱导的小鼠肝脏组织中miR-30b表达下调，miR-30b可减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤，抑制肝细胞凋亡，促进肝细胞的损伤修复〔16〕。过氧化氢处理心肌细胞可下调miR-30b的表达，miR-30b通过抑制亲环素(Cyp)D可保护心脏免受缺血/再灌注损伤和减少心肌梗死范围〔17〕。本研究结果表明在高糖诱导的肾小管上皮细胞中miR-30b-5p表达水平降低，miR-30b-5p过表达可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡。

TNF-α主要由巨噬细胞和T细胞产生，可直接损害肾小球系膜细胞和上皮细胞，还能诱发其他炎症因子的释放，促进DN的炎症过程〔18〕。研究发现高葡萄糖激活的巨噬细胞释放的TNF-α可促进足细胞凋亡，而阻断TNF-α的分泌可减弱足细胞凋亡和延缓DN进展〔19〕。IL-6是免疫反应和葡萄糖代谢的关键介质，IL-6受体通过抑制炎性和减少胰岛素抵抗，起到延缓糖尿病肾损伤的作用〔20〕。在慢性压迫性损伤的大鼠模型中lncRNA XIST高表达，XIST下调可通过降低炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6来抑制神经炎症〔21〕。

综上，lncRNA XIST可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡，改善高糖诱导的HK-2细胞损伤，其机制可能与miR-30b-5p的表达及炎症因子的含量有关。