维生素D通过自噬通路减轻EAE小鼠神经功能损伤的影响

陈培材，廖伟锋，饶俊平

中山大学附属第三医院粤东医院 神经内科 (广东 梅州 514000)

多发性硬化(MS)属于自身免疫疾病，主要表现为中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变，常会累及脑室周围白质、视神经、脊髓、脑干和小脑等，是导致中青年致残的重要因素。目前临床上缺乏有效的根治措施，而且治疗费用高昂，给患者及其家庭带来沉重负担。近年来，研究显示：维生素D(VD)缺乏是引发MS的危险因素[1]。因此，VD也开始应用与MS治疗中，但其作用机制尚不明确。研究显示：T细胞免疫在MS发病中起到了重要作用，而自噬又参与维持免疫系统平衡，同时VD能激活自噬[2]。为了阐明VD通过影响自噬改善MS的可能性，为VD在MS预防和治疗中的应用提供参考，本研究建立了MS的动物模型进行研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂

(1)实验小鼠：6～8周的健康雌性C57BL/6及同源Atg5(+/-)小鼠各12只，体重20～30g，购自上海杰思捷实验动物有限公司，22～26℃的饲养环境、12h光照周期，饮水摄食自由。(2)造模试剂：MOG35-55、完全福氏佐剂、结核菌素H37Ra、百日咳毒素均购自美国默克集团。(3)实验相关试剂：蛋白提取试剂盒、BCA蛋白测定试剂、LC3抗体、Atg5抗体、荧光标记羊抗兔二抗、HE染色液、髓鞘染色试剂盒等。(4)实验设备：台式高速低温离心机、Varioskan LUX多功能酶标仪、光学显微镜、石蜡切片机、双恒定时电泳仪等。

1.2 实验方法

(1)实验分组：将6～8周的健康雌性C57BL/6及同源Atg5(+/-)小鼠各12只，分别随机分4组，A组为C57BL/6小鼠+蓖麻油，B组为C57BL/6小鼠+1,25(OH)2D3，C组为Atg5(+/-)小鼠+蓖麻油，D组为Atg5(+/-)小鼠+1,25(OH)2D3，各6只。

(2)动物模型建立：将MOG35-55多肽250μg溶于500μL生理盐水中，并与含有1mg/mL结核菌素的500μL完全福氏佐剂混合，再加入结核杆菌H37Ra将结核菌素补充到400ng，将上述材料充分混合成油包水乳剂，制成完全抗原，在小鼠双侧背部4点行皮下注射。免疫后第0h和48h往小鼠腹腔内注射500ng百日咳毒素，建立小鼠EA3E模型，免疫当天为0天。

(3)药物干预：用洁净的蓖麻油将1,25(OH)2D3稀释到浓度为1μg/mL，B组、D组小鼠从免疫当天起每隔2天腹腔注射1,25(OH)2D30.1mL，A组、D组从免疫当天起每隔2天腹腔注射0.1mL蓖麻油，在造模后20天处死小鼠，留取脑组织、脊髓、脾脏。

(4)临床评分方法：自免疫当天起，分别与8∶00和16∶00采取双盲法对4组小鼠神经功能进行评分，评分标准为国际通用的Kono评分标准[3]具体如下：0分为神经系统检查正常；1分为尾部紧张；2分为尾部松弛；3分为共济失调，后肢轻瘫；4分为后肢完全瘫痪；5分为濒死状态或死亡。

(5)病理组织学检查：制作脑和脊髓组织的组织切片，采用HE染色观察脑和脊髓组织炎性细胞的浸润情况，采用砂罗铬花青法(SolochromeCyanin)染色观察髓鞘的脱失情况。

(6)炎症因子检测：采用ELISA法检测4组小鼠脑及脾脏中IFN-γ、IL-4、TGF-β、IL-17、TNF-α等细胞因子的表达情况。

(7)自噬相关蛋白表达：采用蛋白质印迹法(Westernblot)测定4组小鼠脑和脾脏中自噬相关蛋白(LC3、Atg5)的表达，采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)测定4组小鼠脑和脾脏中自噬相关蛋白(LC3、Atg5)的mRNA表达。

1.3 评价指标

比较4组的神经功能评分、HE染色、Solochrome Cyanin染色情况和IFN-γ、IL-4、TGF-β、IL-17、TNF-α等炎症因子在4组小鼠脑及脾脏中的表达，以及4组小鼠脑和脾脏中自噬相关蛋白(LC3、Atg5)的蛋白表达及mRNA表达。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 VD通过自噬通路可以减轻EAE小鼠的神经组织损伤程度

到取材为止，A、C、D组小鼠发病率为100%，B组发病率为11.1%。通过比较4组的神经功能评分均数发现，自第11天起，B组小鼠的神经功能评分明显低于A、C、D组(均P<0.05)；A、C、D组小鼠的神经功能评分无明显差异(P>0.05)。如表1所示。各组脑和脊髓组织切片HE染色显示：C、D组可见弥漫的炎性细胞浸润以及“血管袖套”样改变；A组发病高峰期可见弥漫的炎性细胞浸润，个别切片灰、白交界部位存在“血管袖套”样改变，为炎性细胞由小血管渗出并包绕在其周围所致；B组基本未见炎性细胞浸润征象。Solochrome Cyanin染色显示，C、D组可见明显髓脱失情况；A组发病高峰期脊髓白质内可见成片髓鞘脱失区域，呈白色空泡样变；B组脊髓白质内髓鞘基本完整，无明显脱失区域。

表1 4组的神经功能评分比较 (n=6)

2.2 VD可以改善EAE小鼠的炎症相关指标

B组的IFN-γ、TNF-α、IL-17表达低于A、C、D组，TGF-β、IL-4表达高于A、C、D组，差异均存在统计学意义(P<0.05)；A、C、D组的IFN-γ、TGF-β、IL-17、IL-4、TNF-α表达无明显差异(P>0.05)。如表2所示。

表2 4组的炎症相关指标比较 (n=6)

2.3 VD可以调节EAE小鼠的自噬基因表达

B组的Atg5蛋白水平高于A组，LC3蛋白水平低于A、B、C组，C、D组未检测出Atg5蛋白含量，见图1。B组的LC3 mRNA表达量低于A、C、D组(P<0.05)，A、C、D组LC3 mRNA表达量无明显差异(P>0.05)，见图2。

图1 4组小鼠脑和脾脏中自噬相关蛋白(LC3、Atg5)表达

图2 4组小鼠脑和脾脏中LC3B mRNA表达比较注：B组与A组相比，aP<0.05，B组与C组相比，bP<0.05，B组与D组相比，cP<0.05；A组与C组相比，dP>0.05；A组与D组相比，eP>0.05；C组与D组相比，fP>0.05

3 讨论

目前临床认为MS发病可能与病毒感染、自身免疫反应、环境因素等多种因素有关。先天携带易感性基因的人更易发生免疫调节紊乱，受后天环境的影响可能会诱发对中枢神经系统髓鞘成分的异常免疫应答反应。研究显示，MS患者血液中Atg5 mRNA及蛋白水平明显升高[4]。Atg5作为自噬体形成的重要基因，不仅可以推动自噬体向两端延伸，还可以推动LC3向自噬体靠拢，如果缺乏Atg5会阻碍溶酶体与自噬体融合，由此可以看出自噬参与了MS的发生。自噬是在进化中高度保守的应用溶酶体降解胞内大分子以及细胞器的分解代谢过程，其在免疫系统的发育、稳态平衡等过程中发挥了重要作用[5]。但目前关于MS与其自噬水平的研究较少。已有研究显示，VD代谢异常与MS等多种自身免疫性疾病易感性增加有关，且VD能够调节MS免疫并发挥治疗作用[6]。同时VD还可以激活自噬，自噬可能是VD生物活性的重要内在机制之一。由此可以推测上调自噬可能在VD对MS的保护作用中发挥关键作用。为了证明这一推测，本研究建立了MS的动物模型，观察Atg5敲除是否对VD的保护作用产生影响，并进一步阐明MS的发病机制。

本研究结果显示，到取材为止，A、C、D组小鼠发病率为100%，B组发病率为11.1%。自第11天起，B组小鼠的神经功能评分明显低于A、C、D组(均P<0.05)。由此可知，应用VD可以有效减轻EAE小鼠神经功能损伤，但同时是应用VD，敲除Atg5的小鼠却依旧全部发病，说明VD想要发挥神经功能保护作用需通过自噬通路实现。

近年来，研究证实，MS不仅限于中枢神经系统的白质部分，脊髓、丘脑等灰质部分也存在病理改变，比如脱髓鞘和血管“套袖样”改变等，甚至在MS早期未出现明显炎症病理改变时就存在轴索等异常。本研究显示，C、D组脑和脊髓组织切片HE染色可见弥漫的炎性细胞浸润以及“血管袖套”样改变；A组发病高峰期可见弥漫的炎性细胞浸润，个别切片灰、白交界部位存在“血管袖套”样改变，为炎性细胞由小血管渗出并包绕在其周围所致；B组基本未见炎性细胞浸润征象。Solochrome Cyanin染色显示：C、D组可见明显髓脱失情况；A组发病高峰期脊髓白质内可见成片髓鞘脱失区域，呈白色空泡样变；B组脊髓白质内髓鞘基本完整，无明显脱失区域。由此可知，发病的EAE小鼠的确存在神经凋亡和损伤的情况，同时可知自噬在EAE免疫调节中发挥关键作用。

脑血管屏障破坏后毛细血管静脉周围脱髓鞘是引发MS主要病因之一。MS发病早期，Toll样受体和核苷酸结合寡聚样受体会对病原体相关的抗原进行识别，并诱导非特异性免疫应答反应，使活化的CD4+T细胞分化成TH17等相应的炎性损伤细胞，进而分泌多种炎性因子及炎性趋化因子，进一步加重炎症反应和脱髓鞘损伤。本研究测定4组小鼠脑及脾脏中IFN-γ、TNF-α等炎症因子的结果显示，B组的IFN-γ、TNF-α、IL-17表达低于A、C、D组，TGF-β、IL-4表达高于A、C、D组(均P<0.05)。这提示VD可以改善EAE小鼠的炎症相关指标。

此外，本研究结果还显示，B组的Atg5蛋白水平高于A组，LC3蛋白水平低于A、B、C组。B组的LC3 mRNA表达量低于A、C、D组(P<0.05)。这提示VD可以提升EAE小鼠的Atg5表达，促进自噬体形成增多。一般造成LC3增多的原因有两种，一是自噬体形成增多，二是自噬体降解受阻。Atg5可以推动LC3向自噬体靠拢，敲掉Atg5后自噬体降解会受阻，从而导致LC3增多。VD可以提升Atg5表达，推动LC3向自噬体靠拢，形成更大的复合物，进而导致LC3含量减少。而仅注射助溶剂的EAE小鼠，由于助溶剂不具备VD的功效，所以不会推动LC3向自噬体靠拢，影响自噬体降解。基于本研究的是LC3蛋白及mRNA表达情况可以推断发病期的EAE小鼠体内存在自噬体降解受阻的现象。

综上所述，VD可以通过调节自噬基因的表达介导保护神经，其有望成为治疗多发性硬化症(MS)的新方向。