YBX3通过MAPK途径促进鼻咽癌增殖和生长的实验研究

杨 明 邓婷婷 王雨洁 聂国辉 范小琴

在中国，鼻咽癌的发生率和死亡率居世界之首，是我国重点防治的恶性肿瘤之一[1]。鼻咽癌发病位置隐匿，临床确诊时多为中晚期[2]。在临床，对中晚期患者的治疗效果不佳，5年生存率低[3]。因此，深入研究鼻咽癌发生和发展的分子机制，寻找有效的潜在治疗靶点对提高鼻咽癌患者生存率具有非常重要的意义。核酸结合蛋白3(Y-box protein 3，YBX3)，又称DNA结合蛋白A(DNA binding protein A，DBPA)、冷休克蛋白A(cold shock domain protein A,CSDA)，是核酸结合蛋白家族重要成员之一[4]。研究显示YBX3具有多种生物学功能，在肝癌、结直肠癌、肾癌等多种肿瘤的发生发展中发挥了重要作用[5,6]。如在肝癌中，YBX3的表达与肝癌分期显著相关，可作为炎症诱导肝癌发生的候选蛋白标准物[7]。在个体发育中，YBX3 作为重要转录因子，通过Myc21和E2F促进cyclinD1和PCNA的表达促进细胞增殖[8]。然而，YBX3参与鼻咽癌发生发展的功能和作用目前尚不完全清楚。本研究通过Q-PCR 和Western Blot实验检测YBX3在多种鼻咽癌细胞系中的表达情况，并结合体外分子实验和体内动物实验探索YBX3对鼻咽癌细胞增殖和肿瘤生长的作用；并进一步探索其对鼻咽癌细胞增殖的分子机制，以期为临床鼻咽癌治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

正常鼻咽上皮细胞NP460受赠于香港大学李嘉诚医学院曹世华教授，鼻咽癌细胞SUNE1，CNE1，CNE2，5-8F本实验室保存。DKSF培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司，RPMI-1640培养基、双抗、0.25%胰酶购买于美国Hyclone公司。CFSE试剂盒、Trizol试剂购于美国Life公司；CCK8试剂盒购于日本Dojindo公司；YBX3，p38，p-p38，PCNA，GAPDH，兔二抗，鼠二抗购买于CST公司；逆转录和SYBR荧光定量试剂盒购买于美国Roche公司。

1.2 细胞培养

正常鼻咽上皮NP460细胞用DKSF培养基培养；鼻咽癌细胞SUNE1，CNE1，CNE2，5-8F用加1%青链霉素双抗和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养；培养箱条件37 ℃，5%CO2，细胞培养到融合率达90%以上时，加胰酶消化传代或实验。

1.3 细胞瞬转/稳转干扰试验

YBX3 SiRNA瞬转干扰试剂盒和慢病毒ShRNA稳转试剂盒购买于中国吉玛公司和上海吉凯基因。瞬转时，5-8F细胞用转染试剂lip2000按试剂盒说明书操作，24小时后继续后续实验。稳转时，5-8F细胞按试慢病毒剂盒说明书操作，48小时后用1 μg/ml嘌呤霉素筛选稳定敲除YBX3的细胞并验证后用于后续实验。

1.4 CFSE细胞增殖实验

瞬转YBX3 SiRNA的5-8F细胞消化、重悬、计数后，制备1×106/100 μl 浓度的细胞悬液，加入CFSE染料至终浓度为5 μM，置于室温避光孵育10 min，加完全培养基终止离心，铺板，48 h后，消化上流式检查，实验重复3次。

1.5 CCK8细胞增殖实验

稳转YBX3 ShRNA的5-8F细胞消化、重悬、计数后，铺于96孔板每孔2000个细胞，每组每个时间点做3个复孔，分别在24 h、48 h、72 h后弃培养基，加入100 μl含有10 μl CCK8试剂，37 ℃孵育3 h后，上酶标仪检测吸收波长为OD 450 nm，实验重复3次。

1.6 克隆形成细胞增殖实验

稳转YBX3 ShRNA的5-8F细胞消化、重悬、计数后，铺于6孔板每孔400个细胞，每组做3个复孔，1周后弃培养基，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，实验重复3次，计数并统计克隆个数。

1.7 Western blot 实验

细胞和组织总蛋白用RIPA ( 加入1×蛋白酶抑制剂和1×磷酸酶抑制剂) 裂解液裂解提取。总蛋白浓度用BCA蛋白定量法提取。总蛋白10 μg用10%的SDS-PAGE跑胶分离后，转膜、封闭、一抗(1∶1000)4 ℃孵育过夜、二抗(1∶2000)室温孵育2 h、ECL显影。

1.8 Q-PCR实验

细胞总RNA通过Trizol试剂常规提取方法，总RNA浓度用酶标仪定量后，取1μg总RNA按逆转录试剂盒说明书操作逆转成cDNA，相对荧光定量检测目的基因RNA表达情况。实验所用引物如下：YBX3上游引物：5'-ACCGGCGTCCCTACAATTAC-3'，下游引物：5'-GGTTCTCAGTTGGTGCTTCAC-3' ； GAPDH上游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'， 下游引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

1.9 动物实验

所有动物实验均按照深圳大学动物伦理要求实验。5～6周雌性裸鼠购于北京华富康动物有限公司，动物许可证批号：SCXK(京)2019-0008。鼻咽癌荷瘤形成实验，5-8F YBX3-Control组和5-8F YBX3-ShRNA组细胞2×106个细胞用30 μl PBS重悬，注射器打于小鼠背部皮下，10天后开始测量肿瘤，间隔4天测量一次，30天后安乐处死小鼠，收集肿瘤，称肿瘤重量，拍照后，取肿瘤组织保存用于后续实验。

1.10 统计方法

所有数据统计分析均用Graphpad Prism 7.0 软件分析。所有计量资料均用均数(mean)±标准差(SD)，不同组间比较用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 YBX3在鼻咽癌细胞中高表达

Western blot结果显示与正常鼻咽上皮细胞NP460相比，YBX3在鼻咽癌细胞中的蛋白水平表达显著升高，且在恶性程度比较高的5-8F细胞中表达最高(图1A)。进一步Q-PCR实验结果显示YBX3在鼻咽癌细胞RNA水平也得到相似得结论，且差异具有统计学意义(P<0.01，图1B)。综合考虑，选取5-8F细胞用于后续功能和分子机制的研究。

注：A为Western blot 检测YBX3在正常鼻咽上皮和鼻咽癌细胞中的蛋白表达情况；B为Q-PCR 检查YBX3在正常鼻咽上皮和鼻咽癌细胞中的mRNA表达情况。

2.2 YBX3干扰效率检测

采用SiRNA 瞬转和慢病毒ShRNA稳转干扰5-8F细胞YBX3的表达。Western blot 结果显示与YBX3-Control 组比较，三条SiRNA瞬转干扰YBX3的蛋白水平表达情况，其中第二和第三条SiRNA效果显著(图2A)；而三条慢病毒ShRNA稳转干扰YBX3的蛋白水平表达情况，三条ShRNA的敲除效果都很显著(图2C)。进一步Q-PCR实验结果显示SiRNA和ShRNA干扰YBX3表达在RNA水平也得到与Western blot相似得结果，且差异具有统计学意义(P<0.01，图2B和2D)。综合考虑，分别选择了SiRNA和ShRNA干扰效果最显著的第二条和第三条用于后续体内外功能和分子机制的研究。

2.3 YBX3促进鼻咽癌细胞增殖

将上述瞬时干扰YBX3表达后的5-8F细胞进行CFSE细胞流式增殖实验，结果显示在CFSE染色48小时后，YBX3-SiRNA 组细胞荧光强度递减显著减慢，提示细胞增殖减慢(图3A)。之后再利用稳转干扰YBX3表达的5-8F细胞进行CCK8和克隆形成实验。在CCK8实验中，结果显示与YBX3-Control组相比，YBX3-ShRNA组细胞增殖活性显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01，图3B)。在克隆形成实验中，结果显示与YBX3-Control组相比，YBX3-ShRNA组细胞单克隆形成数目也显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01，图3C、3D)。总之，以上细胞增殖相关实验结果数据表明YBX3能促进鼻咽癌细胞的增殖。

2.4 YBX3促进鼻咽癌肿瘤生长

将YBX3-Control和YBX3-ShRNA的5-8F细胞注射裸鼠皮下荷瘤实验，实验结果显示与YBX3-Control组比较，YBX3-ShRNA组显著抑制鼻咽癌肿瘤生长的重量和大小，差异具有统计学意义(P<0.01，图4A-4C)。以上在体实验结果证实敲除YBX3的表达显著抑制鼻咽癌肿瘤生长。

注：A为Western blot 检测5-8F细胞siRNA瞬转干扰YBX3蛋白表达情况；B为Q-PCR 检测5-8F细胞SiRNA瞬转干扰YBX3 mRNA表达情况；C为Western blot 检测5-8F细胞慢病毒shRNA稳转干扰YBX3蛋白表达情况；D为 Q-PCR 检测5-8F细胞慢病毒shRNA稳转干扰YBX3 mRNA表达情况。

2.5 YBX3促进鼻咽癌肿瘤生长的分子机制

通过Western blot实验检测观察到干扰YBX3后细胞总p38无显著变化，但p-p-38显著降低，明显改变了MAPK p-38通路的活性(图5)。进一步下游增殖关键蛋白Western blot检测，发现干扰YBX3的表达后显著降低PCNA的表达(图5)。以上结果表明，YBX3可通过调节MAPK p38/PCNA途径促进鼻咽癌肿瘤生长。

图5 YBX3促进鼻咽癌肿瘤生长的分子机制

3 讨论

鼻咽癌是一种具有明显地域性的肿瘤，也是我国重点防治的恶性肿瘤之一[9]。鼻咽癌的发生发展和转移受多种因素参与，其中肿瘤细胞异常增殖是影响肿瘤生长的最重要的因素[10]。近年，研究显示YBX3在多种肿瘤细胞中异常表达，并参与肿瘤细胞多种生物学过程[11,12]。而在鼻咽癌中，目前只有马俊教授团队利用临床鼻咽癌转移和非转移的鼻咽癌患者组织通过微阵列分析发现YBX3 可能是鼻咽癌转移的一个候选蛋白，但有关YBX3与鼻咽癌细胞增殖和生长的生物学作用和机制目前尚未见报道[13]。

本研究首先对比正常鼻咽上皮细胞NP460和不同鼻咽癌细胞中YBX3的表达差异，结果发现与NP460相比，鼻咽癌细胞中YBX3蛋白和RNA的表达显著升高，且恶性程度较高的5-8F细胞中YBX3表达最高，由此推测YBX3基因异常高表达可能参与了鼻咽癌的发生发展。肿瘤细胞异常增殖是肿瘤生长的核心机制，而肿瘤细胞增殖受多种信号通路共同调控[14]。本研究通过多种细胞增殖实验发现干扰YBX3的表达显著抑制鼻咽癌细胞的增殖；同时，小鼠在体的荷瘤实验结果也发现YBX3-ShRNA组显著抑制了肿瘤生长。这些体内外实验结果均证实YBX3在鼻咽癌细胞增殖和肿瘤生长中发挥了重要作用。

随后，本项目对YBX3促进鼻咽癌增殖的分子机制进行了初步研究。研究显示 MAPK通路的激活参与细胞多种生物学功能，如细胞增殖、迁移、生长和凋亡[15]。MAPK通路主要包括三类激酶：MAPK/p38、MAPK/ERK和MAPK/JNK，它们分别通过磷酸化形式改变其活性而发挥生物学作用[16]。此外，MAPK途径在肿瘤中异常激活已被证实可作为抗肿瘤治疗的靶标；近年发现其在鼻咽癌中异常激活并对鼻咽癌的发生发展起了重要作用[17,18]。本研究发现与YBX3-Control 组相比，YBX3-ShRNA组显著抑制MAPK p38通路活性。此外，本研究还检测了细胞增殖相关基因的表达，结果证实与YBX3-Control 组相比，YBX3-ShRNA组PCNA的表达显著抑制[19,20]。 PCNA是一种高度保守的36～37kD的蛋白，其作为细胞增殖活性的下游指标已被广泛应用，尤其在肿瘤细胞增殖中的异常表达水平与肿瘤细胞增殖、转移等密切相关[21,22]。以上结果证实YBX3参与鼻咽癌细胞增殖通过MAPK p38/PCNA是其一个新的下游分子机制。

注：A为CFSE检查siRNA干扰YBX3后对细胞增殖的影响。B为CCK8检查shRNA干扰YBX3后对细胞增殖活性的影响。C为单克隆形成实验检查shRNA干扰YBX3后对细胞增殖的影响。D为单克隆形成实验结果统计。

综上，本研究证实YBX3基因异常高表达参与了鼻咽癌的生长。在鼻咽癌中YBX3通过MAPK p38/PCNA途径参与调控鼻咽癌细胞增殖和肿瘤生长。项目下一步将探讨YBX3在鼻咽癌患者中的表达及与患者的生存相关性分析，以期为临床治疗提供有力证据。

注：A为5-8F荷瘤组织图(每组6只老鼠6个肿瘤)；B为5-8F肿瘤重量图(每组6只老鼠6个肿瘤)；C为5-8F肿瘤生长曲线图(每组6只老鼠6个肿瘤)。