miR-21、miR-125b与舌鳞状细胞癌患者预后生存的关系

孙 昕 李 宏 冯 琦 刘 晶

舌鳞状细胞癌为常见口腔恶性肿瘤，近年来发病率逐年上升。由于舌癌发展速度快、侵袭力较强，大多患者在确诊时病灶已发生转移，预后较差。临床首选手术治疗舌鳞状细胞癌，但由于该肿瘤恶性程度与侵袭性较高，颈部淋巴结存在迁移风险，多数患者需辅助阳性切缘和神经浸润测定，且术后需进行放化疗干预[1-2]。因舌体组织具有特殊生理结构和功能，血液循环和淋巴丰富，舌体活动性高，舌鳞状细胞癌易发生迁移，局部有复发可能性，导致患者术后生存率低。miRNA为内源性非编码RNA，分布于真核细胞体内，调控活性较大。大多miRNA分布于宿主因子introns中，与其因子共用启动子和转录原件，待mRNA生成后将内含因子剪切而产生pri-miRNA。成熟的miRNA产生多核酸酶剪切加工长初级转录物质，后装配至RNA诱导的沉默复合物中，经碱基互补配对以识别靶向mRNA，并将其降解或抑制其翻译[3-4]。为此，本研究通过对86例舌鳞状细胞癌患者癌组织与癌旁正常组织的 miR-21、miR-125b表达情况进行对比，并经Kaplan-Meier分析生存曲线，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年7月至2020年6月我院收治的86例舌鳞状细胞癌患者手术切除的癌组织与对应的癌旁正常组织，其中男性47例，女性39例；年龄为45～78岁，平均(61.58±15.86)岁；组织分化程度：低分化26例、中分化31例、高分化29例；淋巴结转移情况：未发生转移54例、发生转移32例；临床分期：Ⅰ期18例、Ⅱ期23例、Ⅲ期26例、Ⅳ期19例。纳入标准：符合《口腔颌面部恶性肿瘤治疗指南》标准[5]，且经手术后病理检查确诊为舌鳞状细胞癌；术前无放化疗治疗；签署知情同意书。排除标准：合并其他恶性肿瘤患者；无手术指征患者；术后病情复杂再次治疗患者；长期使用非甾体抗炎药患者；术前接受放化疗或免疫治疗患者；感染性疾病患者；精神疾病及意识障碍患者。

1.2 方法

RNA提取：①取舌鳞状细胞癌组织与对应癌旁正常组织，于液氮下研成粉末，刮入EP管中；②管内分别加入裂解液充分混匀，于室温下静置；③管内加入氯仿，EP管上下颠倒数次，当其溶液变为乳白色后，静置10 min；④使用离心机进行例行，静置，EP管内分成3层，上层液相中含有RNA；⑤将上清液移到新的EP管内，加入异丙醇，于低温下沉淀，后离心5 min；⑥加入预冷乙醇，上下颠倒后离心；⑦弃除上清液干燥的RNA沉淀，加入DEPC水混匀，于室温下溶解。采用分光光度仪检测RNA的纯度，良好RNA的OD260/OD280位于1.8～2.0，该数值表明RNA纯度合格。

逆转录：①于PCR管内配置逆转录反应体系；②配置PCR体系，振荡混匀后离心，在低温冰盒上操作，管内先后加入DNA模板与引物，加入MIX体系，待无气泡产生后将PCR管放入PCR仪器中，逆转录体系中于37 ℃中保温使其完全反应后放置85 ℃中终止反应。③向体系中加入ddH2O进行稀释，放置冰箱内保存待用。

PCR检测：①配置反应体系；②配置PCR反应条件：95 ℃进行15 min预变，进入循环后，于94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，对荧光进行采集，共40循环；于60～95 ℃下融解，内参设为U6，重复进行3次试验，采用2-△△CT，△△CT=(Ct目标基因-Ct管家基因)研究组-(Ct目标基因-Ct管家基因)对照组，计算相对定量法检测miR-21、miR125b表达量。

1.3 随访

对患者进行半年时间随访，包括门诊、电话等形式，随访截止时间为2020年12月31日。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 癌组织与癌旁组织中miR-21、miR125b表达量比较

舌鳞状细胞癌组织中miR-21、miR125b表达量显著高于癌旁正常组织(P<0.05)。见表1。

表1 癌组织与癌旁组织中miR-21、miR125b表达量比较

2.2 舌鳞状细胞癌患者临床参数与miR-21、miR125b表达量的关系

舌鳞状细胞癌组织中miR-21、miR125b表达与患者性别、年龄无关(P>0.05)，与组织分化程度、颈淋巴转移和临床分期有关(P<0.05)。见表2。

表2 舌鳞状细胞癌患者临床参数与miR-21、miR125b表达量的关系

2.3 舌鳞状细胞癌中miR-21、miR125b表达对预后生存影响

半年随访中，共17例患者死亡，69例存活。舌鳞状细胞癌患者预后的单因素分析，存活与死亡患者在颈淋巴结有无转移、临床分期、miR-21与miR125b表达量方面比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。经miR-21与miR125b表达与患者预后相关性分析，miR-21与miR125b表达量越高患者生存率越低。见图1。

图1 舌鳞状细胞癌Kaplan-Meier生存分析

表3 舌鳞状细胞癌患者预后的单因素分析

2.4 舌鳞状细胞癌患者预后影响因素分析

经Cox比例风险回归模型分析显示，miR-21与miR125b高表达、发生颈淋巴结转移、临床分期在Ⅲ～Ⅳ期为舌鳞状细胞癌患者预后的影响因素(P<0.05)。见表4。

表4 舌鳞状细胞癌患者预后影响因素Cox比例风险回归模型

3 讨论

舌鳞状细胞癌为口腔常见恶性肿瘤，发病率占口腔恶性肿瘤的一半[6-7]，恶性程度与侵袭性均较高，易发生淋巴结转移。舌鳞状细胞癌发病原因与机制较复杂，治疗的首选方式为手术，且该肿瘤病灶侵袭力强、生长速度快且恶性程度高，易使患者舌肌运动受到限制，进而影响其吞咽进食和语言等功能，且患者大多预后不良[8-9]。

微小核糖核酸(miRNA)为非编码单核小核糖核酸分子，约22个核苷酸长度，常与靶mRNA非翻译区域进行互补配对，使其降解或转录后阻碍翻译过程，于转录后调控靶向基因的表达。miRNA可参与机体多数病理生理过程，与肿瘤发生发展有密切关系。miR-21为发现较早的有致癌基因的人类miRNAs，位于17q23.2染色体脆性区域，具有自主转录单位，能调节ERK/RAS/MEK通路以抑制基因凋亡表达[10-12]。miR-21靶基因PTEN能抑制P13K/Akt信号转导途径，活化Akt经磷酸化激活或抑制下游靶蛋白表达，可调控细胞增殖分化及凋亡。 研究显示，舌鳞状细胞癌患者体内血浆miR-21表达水平上升，可能与肿瘤侵袭及术后病灶复发有关。miR-21在多种肿瘤组织中表达水平上升，能调控PTEN、p53或mTOR/PI3K/AKT基因或通路以发挥癌基因作用[13-14]。本研究中舌鳞状细胞癌组织中miR-21表达水平上升，临床分期晚，且具有淋巴结转移患者miR-21表达水平更高，miR-21高表达患者生存率低于低表达患者，miR-21高表达为影响患者预后的危险因素，表明miR-21高表达与舌鳞状细胞癌发生发展具有密切关系[15]。

miR-125b在头颈部位恶性肿瘤发生发展中作用较为突出，可在转录水平对基因表达能有效调控，miR-125b多通过作用于细胞增殖、分化、凋亡等干扰肿瘤发生发展，为抑癌特性的基因，在口腔、皮肤等鳞状细胞癌与肝癌等体内表达下降[16]。肖丙秀等[17]指出miR-125b在卵巢组织中处于低表达，但在卵巢癌细胞中呈高表达，阻碍肿瘤诱导血管生成，可能与HER2、HER3表达具有紧密关联。陈筱雪等[18]通过PCR实验检测膀胱癌组织及癌旁组织中miR-125b 表达情况，结果显示相对于正常组织，miR-125b在肿瘤组织中呈低表达。侯志伟等[19-20]报道显示舌鳞状细胞癌衍生细胞与样品中miR-125b表达下调，能降低舌鳞状细胞癌细胞增殖率，且能增强放射敏感性并减少ICAM2-mRNA表达，且miR-125b表达与肿瘤分期与患者生存率有关。

综上所述，舌鳞状细胞癌组织中miR-21、miR-125b呈高表达状态，且与患者组织分化程度、颈淋巴结转移和临床分期有关，为影响预后的危险因素，可作为临床预测患者预后生存的标志物。