E-cadherin、PDPN、TLR4在舌鳞状细胞癌中的表达及其与淋巴结转移的相关性研究

王 婧 李海婷

目前我国头颈部恶性肿瘤的发病率约15/10万，而头颈部恶性肿瘤中的舌鳞状细胞癌更是排在恶性肿瘤的第6位[1]。由于舌鳞状细胞癌的发病部位特殊，舌内血管较为丰富，且运动频繁，导致容易出现早期淋巴结转移，并且治疗后也容易复发[2]。粘附分子E(epithelial-cadherin，E-cadherin)是一种粘附分子，在胚胎的形成、组织结构的维持中发挥着重要意义，并参与到肿瘤的增生、分化和转移当中[3]。平足蛋白(podoplanin，PDPN)能够促进淋巴管祖母细胞自胚胎静脉发育生成淋巴内皮细胞，是肿瘤淋巴结转移的必要条件[4]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4 TLR4)是Toll样受体的一种，在调剂免疫反应中发挥着重要的作用，近年来已被证实参与肿瘤的分化和转移当中[5]。本研究选取我院收治82例舌鳞状细胞癌患者临产资料，以研究E-cadherin、PDPN、TLR4在舌鳞状细胞癌中的表达及与淋巴结转移的相关性研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月～2020年1月我院收治82例舌鳞状细胞癌患者作为研究对象。纳入标准：①患者符合《口腔颌面肿瘤病理学》[6]中舌鳞状细胞癌诊断标准；②患者通过病理学证实为舌鳞状细胞癌；③患者无第二原发肿瘤；④患者术前未接受抗肿瘤治疗。排除标准：①患者存在严重肝肾功能不全；②患者合并其他部位恶性肿瘤；③患者存在严重凝血功能障碍；④患者为妊娠期女性。82例舌鳞状细胞癌患者，男性40例， 女性42例，年龄30～84岁，平均年龄(55.65±20.51)岁，根据TMN分期标准：Ⅰ期31例，Ⅱ期25例，Ⅲ期26例，分化程度：低分化34例，中分化36例，高分化12例，淋巴结转移38例，无淋巴结转移44例。

1.2 方法

E-cadherin表达水平检测方法：手术中切取患者癌组织和周围健康组织，标本连续切片2张，分别采用HE和免疫组化染色法，严格按照SPTM法进行检测，其中对于抗原的修复采用高温高压抗原组织修复法，送往镜检，在光镜下进行观察，胞膜内可观察出棕黄色颗粒则可判断为阳性，参考Shimzu标准，使用半计量法，分别对染色的细胞进行分部和染色分数计算：染色细胞标准：无着色细胞为0分，着色细胞低于组织细胞的三分之一为1分，着色细胞高于组织细胞的三分之一但不高于二分之三为2分，着色细胞高于二分之三为3分；染色细胞深度标准：不着色为0分，色浅为1分，色深为2分。将染色细胞和染色细胞深度分数相加，0分为-，2分为+，3分为++，4分为+++，5分为++++。

PDPN表达水平检测方法：手术中切取患者癌组织和周围健康组织，制成石蜡标本。采用二甲苯脱蜡，乙醇脱水，随后以3%过氧化氢溶液去除标本内源性过氧化物酶，以pH 6.0的柠檬酸钠缓冲液进行微波抗原修复，分别在两个组织内滴加1∶2000稀释的CellSignaling Technology公司的浓缩型兔抗人PDPN单克隆抗体，以4 ℃孵育，并随后进行显色、复染、脱色等操作送往镜检，在光镜下进行观察，染色细胞深度标准：无着色为0分，轻度着色或者浅黄色为1分，中度着色或者深黄色为2分，重度着色或者棕色为3分；在光镜下随机视野内500个细胞，1分为≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～80%，4分为>80%。将染色细胞和染色细胞深度分数相加，0分为-，2分为+，3分为++，4分为+++，5分为++++。

TLR4表达水平检测方法：手术中切取患者癌组织和周围健康组织，制成石蜡标本放于60 ℃烤箱内，随后进行复水、清洗，采用柠檬酸钠微波抗原修复，滴入Santa Cruz公司的兔抗人TLR4多克隆抗体，以4 ℃孵育，并随后进行显色、复染、脱色等操作送往镜检，在光镜下进行观察，400倍光镜下进行技计数，光镜下可发现细胞质以及细胞膜表现为棕黄色则可判定为阳性，切片随机收集10个高倍视野内的细胞，每个切片内所含的阳性细胞数量为阳性细胞率，≥10%则判定为+，≥75%则为++，≤10%则为-。

1.3 观察指标

检测患者舌鳞状细胞癌组织以及癌旁正常组织内E-cadherin、PDPN、TLR4的表达，同时与患者临床特征进行分析。

1.4 方法

2 结果

2.1 舌鳞状细胞癌组织以及癌旁正常组织内E-cadherin表达对比

舌鳞状细胞癌组织中E-cadherin阳性表达率[41.46%(34/82)]显著低于癌旁组织[85.36%(70/82)]，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 舌鳞状细胞癌组织以及癌旁组织中E-cadherin表达对比(例，%)

2.2 舌鳞状细胞癌组织以及癌旁组织内PDPN表达水平对比

PDPN在舌鳞状细胞癌组织中阳性表达率[86.58%(71/82)]显著高于癌旁组织[24.39%(20/82)]，差异具有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 舌鳞状细胞癌组织以及癌旁组织内PDPN表达对比(例，%)

2.3 舌鳞状细胞癌组织以及癌旁组织内TLR4表达对比

TLR4在舌鳞状细胞癌组织中阳性表达率[87.80%(72/82)]显著高于癌旁组织[13.41%(11/82)]，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 舌鳞状细胞癌组织以及癌旁组织内TLR4表达对比(例，%)

2.4 E-cadherin表达与患者临床特征分析

E-cadherin表达与患者性别、年龄无相关性(P>0.05)；TMNⅢ～Ⅳ期E-cadherin表达明显低于TNMⅠ～Ⅱ期，淋巴结转移患者E-cadherin表达水平明显低于无淋巴结转移的患者，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 E-cadherin表达与患者临床特征的关系/例

2.5 PDPN表达与患者临床特征的关系

PDPN表达与患者性别、年龄无相关性(P>0.05)；TMNⅢ～Ⅳ期PDPN表达明显高于TNMⅠ～Ⅱ期，有淋巴结转移患者PDPN表达水平明显高于无淋巴结转移患者，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 PDPN表达与其临床特征的关系/例

2.6 TLR4表达与其临床特征的关系

TLR4表达与患者性别、年龄无相关性(P>0.05)；TMNⅢ～Ⅳ期TLR4表达明显高于TNMⅠ～Ⅱ期，有淋巴结转移患者TLR4表达水平明显高于无淋巴结转移患者，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表6。

表6 TLR4表达与其临床特征的关系/例

3 讨论

由于舌部的血管丰富，并且经常运动，导致舌鳞状细胞癌的转移率明显更高，患者的生存率约在60%，患者死亡的主要原因是淋巴结转移或者复发[7-8]。随着生物分子学的不断进步，多项研究认为肿瘤的发生、发展以及淋巴结转移与生物学分子密切相关[9-10]。目前临床上对于E-cadherin、PDPN、TLR4在舌鳞状细胞癌表达的研究仍较少，本次研究在此基础上对于其与患者临床特征相关性进行分析，以为临床诊断与治疗提供指导。

E-cadherin是一种具有较高钙依赖性的粘附因子，可以在人体的上皮组织内检测到，分别由胞外区、跨膜区以及胞内区构成[11]。E-cadherin能够作为受体也能够充当配体。负责细胞间黏附反应的介导，当E-cadherin发挥作用时，其余粘附系统会失去作用.有研究发现，E-cadherin结构功能出现异常时，上皮结构的生成会出现障碍，将E-cadherin的基因转染肿瘤细胞，能够对肿瘤的侵袭和转录行为进行抑制，说明，E-cadherin是一种肿瘤抑制基因[12]。本研究表示：E-cadherin在患者舌鳞状细胞癌组织的表达显著低于癌旁组织(P<0.05)。Sgaramella等[13]发现：舌鳞状细胞癌患者随着癌组织内E-cadherin表达的升高，淋巴结转移的存在一定的降低趋势。这与本研究结果TMNⅢ～Ⅳ期E-cadherin表达明显低于TNMⅠ～Ⅱ期，存在淋巴结转移患者E-cadherin表达明显低于不存在淋巴结转移的患者(P<0.05)一致。分析因为E-cadherin对癌细胞的同嗜性粘附急性介导，组织癌细胞的脱落，从而限制癌细胞的转移[14]。PDPN在人体的淋巴管内皮细胞中具有较高的表达，同时在侵袭性肿瘤内同样具有一定的表达[15]。本研究表示：PDPN在患者舌鳞状细胞癌组织的表达显著高于癌旁组织(P<0.05)。有研究表示：PDPN在舌鳞状细胞癌组织的表达明显高于癌旁组织，且与淋巴结转移存在相关性[16]，这与本研究结果TMNⅢ～Ⅳ期的患者癌组织内PDPN表达明显高于TNMⅠ～Ⅱ期，存在淋巴结转移患者癌组织内PDPN、表达明显高于不存在淋巴结转移的患者(P<0.05)一致。我们推测可能因为PDPN能够造成E-cadherin的低表达，进而使细胞的接触抑制，引起上皮间质转化，进而促进癌细胞的转移和增生[17]。TLR4属于TLRs 的一种，在多种肿瘤细胞内均有一定的表达。TLR4虽然能够加强人体对于肿瘤的免疫反应，但也能为肿瘤细胞的增殖发育提供环境，促进肿瘤的增殖分化[18-19]。本次研究发现：TLR4在患者舌鳞状细胞癌组织的表达显著高于癌旁组织(P<0.05)。有研究认为TLR4能够促进肿瘤坏死因子-α的分泌，进而促进树突细胞的成熟，加强T细胞以及巨噬细胞的合成，杀死肿瘤细胞。Anna等[20]研究得出，TLR4在患者舌鳞状细胞癌组织的表达明显升高，但与患者的淋巴结转移无相关性。这与本研究结果不一致，分析可能由于病例收集较少所引起。本次研究E-cadherin、PDPN、TLR4在舌鳞状细胞癌中的表达的基础上对其与淋巴结节转移进行相关性研究，为舌鳞状细胞癌的诊断与淋巴结转移预测提供帮助，但是本次研究仍存在一定的局限性，主要因为病例收集较少，且均来自同一省份，可能造成一定的偏差，所以以后应当加大病例的采集。

综上所述，舌鳞状细胞癌患者体内E-cadherin存在明显的降低，PDPN、TLR4明显升高，并且研究发现存在淋巴结转移以及分期较高的患者体E-cadherin显著更低，PDPN、TLR4显著更高。