青稞提取物干预对老年小鼠骨骼肌萎缩的影响

李 言， 孙雨杰， 聂陈志鹏， 王 茹， 应 浩， 王 立,*

(1.江南大学 食品学院/食品科学与工程国家重点实验室， 江苏 无锡 214122；2.上海体育学院 运动科学学院， 上海 200438；3.中国科学院上海营养与健康研究所/中国科学院营养代谢与食品安全重点实验室， 上海 200032)

现代社会，随着人们生活条件的改善和医疗保障水平等的提高，老龄人口的比例不断增加。《2019年世界人口展望》报告预测，全球65岁及以上人口的比例将从2019年的1/10增加到2050年的1/6[1]。由衰老引起的肌肉萎缩是人类最常见的肌肉萎缩类型，表现为肌肉质量、力量的流失，活动能力的下降等[2]。目前，衰老性肌萎缩已成为严重影响中老年人生活质量的重要问题之一，如何预防或延缓衰老性肌萎缩的发生已成为亟待解决的公共健康问题。

运动是公认的改善肌肉质量、肌肉力量和行走速度的最佳方式，可以有效预防或缓解老龄人群的骨骼肌增龄性萎缩，但对大多数老年人来说，保持持续且足够的运动是很困难的[3]。饮食干预作为另一种帮助缓解老年人骨骼肌增龄性萎缩的干预措施被提出。研究表明，骨骼肌中过量活性氧的积累会导致其蛋白降解，相关蛋白合成受阻，进而导致衰老性肌萎缩[4]。食物中的天然多酚类物质具有较高的抗氧化活性，可以有效减少骨骼肌中的氧化应激，抑制NF-κB蛋白核因子(κB nuclear factor)或腺苷酸激活蛋白激酶 [adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]的上调和叉头框转录因子O(forkhead box O,FoxO)的激活，进而抑制骨骼肌的降解[5]。抗氧化化合物的摄入不足会导致骨骼肌抗氧化能力的降低以及骨骼肌力量的下降[6]。青稞是我国青藏高原地区最主要的农作物之一，由于其特定的生长条件而富含酚类化合物、维生素、膳食纤维等生物活性成分[7]，具有独特的抗氧化特性，具备缓解氧化应激并抑制骨骼肌萎缩的潜力[8]，但有关青稞提取物对衰老骨骼肌的作用及其机理还未见报道。本研究将对青稞提取物在衰老骨骼肌中的作用进行探讨，并进一步在分子水平分析其具体的作用机制，以期为青稞的功能性开发和改善衰老骨骼肌新策略的提出提供更多的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青稞(HordeumvulgareL. var. nudum Hook. f)，西藏农业科学院；C57BL/6J小鼠，动物伦理审查编号为JN N020210530c0201220[141]，上海斯莱克实验动物公司；无水乙醇、三氯甲烷、氯仿、异戊烷、多聚甲醛，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；BCA(bicinchoninic acid)蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、总蛋白提取细胞组织裂解液(radio immunoprecipitation assay，RIPA)、十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液、抗荧光淬灭封片液(含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性检测试剂盒、脂质氧化丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；总RNA抽提试剂，美国Invitrogen公司；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)引物序列合成，浙江尚亚生物技术有限公司；核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)反转录试剂盒、SYBR Green Master Mix实时定量PCR试剂盒，日本Takara公司；蛋白Maker，美国Thermo Fisher 公司；ECL化学发光检测试剂盒、PAGE 凝胶制备试剂盒，上海雅酶生物科技有限公司；聚偏氟乙烯 (PVDF)膜，美国Millipore公司；anti-GAPDH、anti-MURF1、anti-Atrogin1、anti-SIRT3、anti-TGF-βR1、anti-mTOR、anti-Acetyl-lysine，美国Cell Signaling Technology 公司；蛋白质免疫印记二抗鼠/兔，Jackson Immuno Research公司；马血清，Gibco公司；anti-Dystrophin，Abcam公司。

1.2 实验动物及分组

实验小鼠均为12月龄的C57老龄化老鼠，饲养于无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级动物房，12 h昼夜循环。动物房温度和湿度分别保持为(24±2) ℃，55%±5%。饲养期间小鼠以正常饲料喂养，可以自由进食和饮水。

30只实验小鼠在为期一周的新环境适应期结束后，被随机分为3组(n=10)：空白对照组、青稞水提物干预组(每日灌胃800 mg/kg青稞水提物，以体质量计)、青稞醇提物干预组(每日灌胃800 mg/kg青稞醇提物，以体质量计)。空白对照组的小鼠按照体质量每日灌胃相应体积的超纯水。此外青稞水提物使用超纯水溶解，醇提物与超纯水混合均质后进行灌胃。

1.3 仪器与设备

M1- L236A型商用烤箱，广东美的厨房电器制造有限公司；HWS24型电热恒温水浴锅，上海恒科技有限公司；R- 100型真空旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司；FW100型高速粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；CM3050S型冰冻切片机，德国Leica公司；Nano Drop 2000型分光光度计，美国Thermo Scientific公司；Step One Plus实时荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司；化学发光凝胶成像系统、PCR仪，美国Bio Rad公司；Scientz- 48型高通量组织研磨器，宁波新芝生物科技股份有限公司；LSM880型高分辨率激光共聚焦显微镜，德国卡尔蔡司公司；EchoMRI型核磁(NMR)体成分分析系统，美国EchoMRI公司。

1.4 实验方法

1.4.1青稞提取物的制备

青稞提取物的提取参照Nie等[7]的方法，并稍做修改。青稞经高速粉碎机粉碎后，过60目筛，取适量按照料液比为1∶25(g∶mL)加入去离子水或无水乙醇，于60 ℃水浴中浸提2次，每次1 h，抽滤，合并滤液。提取物于旋转蒸发仪上浓缩至其原始体积的1/8，并将浓缩液冷冻干燥成粉末，分别得到水溶性(WS)和醇溶性(AS)组分。最终产品在-20 ℃中储存，备用。

1.4.2青稞提取物基础成分的测定

采用苯酚硫酸法对青稞提取物总碳水化合物含量进行测定，具体步骤参考文献[9]。总酚含量测定实验的试剂来源于北京索莱宝科技有限公司。蛋白质含量采用考马斯亮蓝法进行测定，具体步骤参考文献[9]。

1.4.3动物实验

每日测量小鼠体质量和摄食量。在青稞提取物干预12周后，所有小鼠预先适应跑步机3 d。根据Jordan等[10]的方法进行小鼠跑步机实验。简单来说，跑步机以5 m/min的速度启动，持续3 min。跑步机以2 m/min的速度连续加速，至20 m/min后，停止加速。在接下来的实验中，跑步机速度保持恒定在20 m/min，直到小鼠精疲力竭(小鼠在15 s内从跑步机上掉下来超过3次被认为是实验的终点)，无法再忍受跑步，记录此时小鼠的累计跑步时间和距离。待小鼠休息2 d后，利用核磁(NMR)体成分分析系统对小鼠的瘦体质量(lean mass)进行检测。随后将小鼠处死，迅速获取其腓肠肌 (GAS)、胫骨前肌 (TA) 和比目鱼肌 (SOL)。将小鼠部分肌肉组织放置于质量分数为4%的多聚甲醛溶液中，其余部分在液氮中速冻，储存于-80 ℃的冰箱中。

1.4.4RNA的提取、反转录和实时荧光定量PCR分析

根据Pan等[11]的方法，从肌肉组织中提取总RNA，并根据RNA反转录试剂盒，SYBR Green Master Mix实时定量PCR试剂盒的操作说明进行后续实验。实验相关引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4.5蛋白免疫印记分析

参照Li等[12]的方法进行Western Blot实验。小鼠肌肉组织加入RIPA裂解缓冲液后，在高通量组织研磨仪中匀浆，随后4 ℃，12 000 r/min离心30 min得到上清液。用BCA试剂盒测定蛋白浓度，并将所有蛋白样品调整为相同浓度后，加入5×蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸10 min得到组织样品。接着用质量分数为10%的SDS-PAGE凝胶进行电泳分离、转模、封闭，加入相应一抗4 ℃摇床过夜孵育，充分洗涤后，用二抗孵育1 h。最后加入显影液，上机检测。

1.4.6SOD与MDA含量的检测

取适量组织样品加入SOD样品制备液，匀浆，4 ℃，12 000 r/min下离心5 min，收集上清液作为待测样品，并根据试剂盒的操作说明测定SOD活性。取适量组织样品加入PBS进行匀浆，12 000 r/min离心10 min，取上清液，并根据试剂盒的操作说明测定MDA含量。

1.4.7免疫组织化学染色

参照Kou等[13]的方法，进行免疫组织化学染色。小鼠肌肉组织用质量分数为4%的多聚甲醛水溶液固定后脱水，石蜡包埋，切片、烘片，并使用Dystrophin抗体进行免疫组织化学染色，在LSM880高分辨率激光共聚焦显微镜下拍摄切片。

1.5 数据处理

采用SPSS软件对实验数据进行分析，结果表示为平均值±标准差。使用One way ANOVA分析多组数据之间的差异性，当P<0.05时为差异显著。

2 结果与分析

2.1 青稞提取物基础成分分析

对青稞水提物与醇提物的基础成分进行测定，实验结果见表2。由表2可知，青稞水提物中含有大量的碳水化合物，部分水溶性多酚以及少量蛋白质。与青稞水提物相比，青稞醇提物中则含有更丰富的酚类化合物，碳水化合物较少。可以看出，青稞醇提物中的碳水化合物含量远低于青稞水提物，这主要是由于提取青稞醇提物所用的无水乙醇会导致大分子碳水化合物的析出[7]。因此，青稞水提物中的碳水化合物含有大量的大分子可溶性多糖，而醇提物中的碳水化合物为小分子糖类。

表2 青稞提取物基础成分分析

2.2 青稞提取物对老年小鼠骨骼肌质量与功能的影响

随着衰老的发生，骨骼肌的质量会逐渐减少，骨骼肌的功能损失会逐步增大[14]。青稞提取物对老年小鼠骨骼肌质量和功能的影响见图1。由图1(a)和图1(b)可见，与对照组相比，青稞提取物灌胃12周后衰老小鼠体质量显著降低，瘦体质量显著增加。由图1(c)和图1(d)可见，与对照组相比，青稞提取物干预显著增加了衰老小鼠力竭时的跑步距离和跑步时间，表明青稞提取物可以有效延缓衰老导致的骨骼肌质量和功能的下降。

抗肌萎缩蛋白(dystrophin)是一种大型支架蛋白。dystrophin通过将细胞骨架与肌肉组织的肌膜相连接，起到维持肌肉细胞完整性的作用[15]。以往的研究表明，衰老会显著降低dystrophin蛋白的表达，最终导致杜氏进行性肌营养不良症(DMD)[16]。由图1(e)和图1(f)可见，与对照组相比，青稞提取物干预显著增加了小鼠腓肠肌中dystrophin免疫荧光的强度，说明这两种青稞提取物均能有效抑制衰老诱导的dystrophin蛋白表达的下降。本研究表明，青稞提取物可以有效缓解衰老导致的小鼠骨骼肌质量和功能的下降。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001；图(e)中白箭头表示处于萎缩的肌纤维。

2.3 青稞提取物对老年小鼠骨骼肌萎缩的影响

青稞提取物对老年小鼠骨骼肌萎缩的影响，实验结果见图2。肌肉环状指基因 1(muscle ring finger1，MURF1)和肌肉萎缩盒F基因(muscle atrophy F-box，Atrogin1)是骨骼肌萎缩的标记物[16]，它们的表达增加会导致肌肉萎缩。为进一步研究青稞提取物是否抑制了老年小鼠的肌肉萎缩，本研究检测了老年小鼠腓肠肌中MURF1、Atrogin1基因和蛋白的表达。由图2可知，与对照组相比，青稞提取物干预显著降低了MURF1、Atrogin1 mRNA和蛋白的表达，说明青稞提取物能有效抑制衰老小鼠的肌萎缩。

*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2.4 青稞提取物对骨骼肌中SIRT3信号表达及肌内氧化应激的影响

青稞提取物对骨骼肌中SIRT3信号表达及肌内氧化应激的影响，实验结果见图3。Sirtuins蛋白家族又被称为长寿蛋白家族，是一种NAD+依赖性脱乙酰酶。Sirtuins蛋白家族中的SIRT3已被证明在维持细胞内线粒体正常功能，缓解骨骼肌氧化应激中起着重要的作用[17]。相关研究表明，小鼠骨骼肌特异性敲除SIRT3，会导致其耗氧量减少，活性氧(reactive oxygen species,ROS)增加，并在骨骼肌中引起氧化应激[18]。近年来，SIRT3被认为是治疗ROS造成的骨骼肌增龄性萎缩研究中的一个新的靶点[14]。由图3(a)可见，青稞提取物干预显著增加小鼠腓肠肌中SIRT3蛋白的表达。和本研究结果一致，Nie等[7]的研究也证实了青稞醇提物和水提物的抗氧化作用与SIRT3信号激活的相关性。

*表示P<0.05，**表示P<0.01。

SOD被认为是抗氧化酶系的重要组成成员，在细胞氧化损伤的第一道防线中起主要作用。SIRT3可以通过去SOD乙酰化以激活SOD，进而清除超氧阴离子自由基[19]。此外，MDA是生物膜上不饱和脂肪酸发生脂质过氧化最重要的产物之一，MDA的产生会加重膜损伤。MDA含量是衡量机体内脂质过氧化程度和自由基水平的一项重要指标[20]。由图3(b)和图3(c)可见，青稞提取物干预不仅显著增加了老年小鼠腓肠肌中SOD的活性，还减少了老年小鼠腓肠肌中MDA的含量，说明这两种青稞提取物均能抑制老年小鼠骨骼肌内的氧化应激。

当机体发生炎症反应时，机体会释放出大量炎症因子，如：肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)、白介素-6 (interleukin-6,IL-6)、转化生长因子-β(transforming growth factor-beta, TGF-β)、白介素-8 (interleukin-8,IL-8)等。炎症因子在骨骼肌的过多积累会导致肌肉萎缩,从而导致肌肉减少症[21]。由图3(d)可见，与对照组相比，青稞提取物干预显著降低了TGF-β受体1(TGF-βR1)的蛋白表达。由图3(e)和图3(f)可见，与对照组相比，青稞提取物干预显著减少了小鼠腓肠肌中炎症相关基因mRNA的表达，表明青稞提取物能有效抑制机体的炎症反应，从而抑制肌萎缩。本研究表明，青稞水提物与醇提物均能通过激活SIRT3途径降低氧化应激反应，从而抑制骨骼肌的衰老。

此外，与水提物相比，青稞醇提物具有更强的消炎及抗氧化作用，这可能与青稞醇提物含有更多酚类活性物质有关[7]。这些酚类活性物质可以有效清除自由基，从而降低衰老引起的氧化应激以及炎症反应。

3 结 论

本研究利用青稞提取物对衰老小鼠进行饮食干预。研究结果表明：长期补充青稞水提物和醇提物均可以有效阻止老年小鼠骨骼肌肌肉重量的减轻，增强其骨骼肌中的线粒体活性，并有效延缓其衰老性肌萎缩的进程，使老年小鼠的运动能力得到增强。从机制上看，这两种青稞提取物均通过激活SIRT3信号通路有效抑制老年小鼠骨骼肌中的氧化应激，进而延缓与衰老相关的肌肉质量与功能的变化。本研究表明，富含抗氧化成分的青稞提取物可以有效延缓衰老性肌萎缩，证明以青稞提取物作原料制备防治衰老性肌萎缩的功能性食品具有较高的可行性。关于青稞提取物是否通过其他信号通路改善老年小鼠的骨骼肌性能，以及青稞提取物中主要功能活性成分的筛选还有待进一步的研究。