马齿苋提取物对鲜切苹果褐变的影响

林 青， 周 聪， 李学进， 李 卢， 李喜宏，*， 李冀新

(1.天津科技大学 食品科学与工程学院/天津科技大学省部共建食品营养与安全国家重点实验室， 天津 300457； 2.新疆农垦科学院， 新疆 石河子 832000)

鲜切果蔬因其天然、方便、新鲜等特点满足了当代快节奏生活下大众消费者的需求，具有较好的市场前景。苹果作为鲜切果蔬行业的主要产品，深受学校午餐项目、餐饮服务机构的欢迎。然而，鲜切苹果表面在贮藏过程中通常会发生酶促褐变，导致外观不佳，保质期缩短，同时降低销量。

众所周知，酚类化合物在植物细胞作为呼吸传递物质，保持酚- 醌动态平衡，当植物细胞受损伤时氧气进入到细胞内进行氧化还原反应，打破平衡，导致醌积累及进一步氧化，最后迅速凝结生成相对不溶的棕色聚合物(黑色素)，进而发生酶促褐变。多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是酶促褐变黑色素生成途径中的关键酶，不仅催化单酚羟基生成二酚，而且使二酚进一步氧化成醌类[1]。然而，PPO活性和酚类含量并不是影响酶促褐变反应的唯一因素。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)主要通过脱氨作用催化L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸，这是酚类物质合成的主要中介，是酶促褐变的关键[2]。除PAL外，过氧化物酶(peroxidase，POD)也可以直接或间接参与酶褐变。近年来，关于防止鲜切果蔬褐变的方法很多，物理方法包括高氧、臭氧、超高压、超声波以及紫外线处理，化学方法包括抗氧化剂以及相关酶抑制剂处理，比如柠檬酸、半胱氨酸以及半胱氨酸酶抑制剂、鳕鱼肽[3]。

马齿苋(Portulacaoleracea)是一种受欢迎的可食用野生草本植物[4]，马齿苋提取物作为一种天然的抗氧化剂，抗氧化性与其含有的生物碱[5]和黄酮类物质[6]有着密切的关系。马齿苋中的黄酮类化合物可以通过光合作用产生，有效防止植物细胞氧化损伤，增强其抗氧化成分。Liu等[7]研究认为马齿苋提取物中外源酚类化合物可以抑制内源酚类化合物的生成，进而抑制PPO、POD、PAL活力。马齿苋提取物表现出良好的生物活性，其作为鲜切果蔬抗褐变剂在食品中的应用值得进一步探究。

本研究以鲜切苹果为对象，采用质量分数0.05%马齿苋提取物浸泡5 min，纱布沥干，于(4±1)℃保存8 d，分析贮藏过程中鲜切苹果关键酶活力变化，系统评价马齿苋提取物对鲜切苹果酶促褐变的抑制效果，以期为鲜切苹果保鲜和天然抗褐变剂开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富士苹果，天津金元宝批发市场；愈创木酚、聚乙烯吡咯烷酮、邻苯二酚、L-苯丙氨酸、β-巯基乙醇、三氯乙酸、乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇、过氧化氢(H2O2)、DPPH、硫代巴比妥酸、无水乙醇等，分析纯，天津市百奥泰科技发展有限公司；马齿苋提取物水溶液，宝鸡市扶风斯诺特生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

WR- 18型精密色差仪，深圳市威福光电科技有限公司；JJ224BC型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；HH- 6型数显恒温水浴锅，邦西仪器科技(上海)有限公司；TGL- 16型高速冷冻离心机，四川蜀科仪器有限公司；H1MF型多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1样品预处理

选择大小均匀、新鲜、成熟度相同的苹果清洗后，用已杀菌的水果刀削皮去除果核，用锋利的切片机获得厚度约为0.5 cm的苹果鲜片，将苹果鲜片用质量分数0.05%的马齿苋提取物溶液浸泡5 min，另取一组用蒸馏水浸泡5 min作为对照。将处理过的苹果鲜片用纱布沥干后均匀放入8号自封保鲜袋内(PE材质、厚度0.05 mm)，置于(4±1)℃条件下贮藏8 d，每隔2 d测定苹果鲜片的特性。

1.3.2褐变指数测定

苹果鲜片表面颜色采用便携式WR- 18型精密色差仪进行测定，包括L*(亮度)、a*(红绿值)和b*(黄蓝值)。根据式(1)计算褐变指数(browning index,BI)[8]。

(1)

1.3.3总酚和抗坏血酸含量测定

采用福林- 酚法[9]测定总酚含量。采用2，6-二氯酚靛酚滴定法[10]测定抗坏血酸含量。

1.3.4相关酶活力测定

参考Fu等[11]的方法测定PPO活力，参考Chen等[12]的方法测定POD活力，参考Song等[13]的方法测定过氧化氢酶(catalase，CAT)活力，参考Mishra等[14]的方法测定PAL活力。

1.3.5抗氧化活性测定

抗氧化活性表示为对DPPH自由基的清除能力[15]。将新鲜的苹果切片磨碎，在4 ℃条件下10 000×g离心15 min，取上清液备用。将4 mL DPPH溶液(257.5 mg/L)和1 mL体积分数95%无水乙醇混合反应30 min后，测量517 nm的吸光度即为A0。然后，将1 mL上清液与4 mL体积分数95%无水乙醇混合反应30 min后，测量517 nm处吸光度即为Ar。最后将1 mL上清液与4 mL DPPH溶液混合反应30 min后，测量517 nm处吸光度即为As。DPPH自由基清除率根据式(2)计算。

DPPH自由基清除率=[1-(As-Ar)/A0]×100%。

(2)

1.3.6丙二醛含量测定

参考Xu等[16]的方法测定丙二醛(malondiadehyde，MDA)含量。

1.4 数据处理

所有数据采用SPASS 17.0软件进行单因素方差分析，分析Pearson相关性，利用邓肯式多重比较法对生理指标进行显著性分析，利用Origin 8.0软件绘图。每组实验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 马齿苋提取物对鲜切苹果褐变控制效果和MDA含量的影响

颜色变化是鲜切果蔬褐变的关键指标之一。马齿苋提取物处理后鲜切苹果的褐变指数与MDA含量的变化见图1。图1(a)可以看出，在马齿苋提取物水溶液中浸泡5 min后，褐变指数的起始值具有较大的差异，同时在鲜切苹果的贮藏过程中，贮藏时间越长褐变程度逐渐增加，经马齿苋提取物处理的鲜切苹果BI上升较慢，且在8 d的贮藏过程中显著低于对照组(P<0.05)，说明马齿苋提取物处理对抑制鲜切苹果褐变有较好的效果。

小写字母不同表示组间数据差异显著(P<0.05)。

在对鲜切苹果氧化损伤程度的分析中，MDA是非常重要的指标，MDA含量越高，代表对细胞膜的损伤越严重，MDA含量变化反映了细胞膜脂过氧化程度[17]。由图1(b)可知，在整个贮藏的过程中，对照组与马齿苋处理组MDA含量整体呈现上升趋势，说明鲜切苹果膜脂过氧化程度加重。但2～8 d时，马齿苋提取物处理组的MDA含量显著低于对照组(P<0.05)，表明马齿苋提取物处理能有效改善膜脂过氧化损伤程度。鲜切造成的机械损伤通常导致活性氧(ROS)的过量产生，直接或者间接启动膜脂过氧化反应，过氧化产物MDA使膜中酶蛋白发生聚合反应，导致植物细胞的氧化损伤，从而加快酶促褐变反应[18]。

2.2 马齿苋提取物对鲜切苹果抗坏血酸含量的影响

抗坏血酸是存在于新鲜果蔬中的高效抗氧化剂。马齿苋提取物处理后抗坏血酸含量变化见图2。与0 d初始值相比，对照组与马齿苋提取物处理组抗坏血酸含量均呈下降趋势，但马齿苋提取物处理组抗坏血酸的含量显著高于对照组(P<0.05)。马齿苋提取物处理后的鲜切苹果在贮藏末期与初期相比抗坏血酸含量下降了29%，而对照组下降了50%。由于机械损伤使受伤细胞与空气完全接触，氧化应激爆发，导致鲜切苹果中抗坏血酸氧化严重，而马齿苋提取物处理能有效减缓抗坏血酸含量的下降，保持鲜切果片抗氧化力，延缓果实衰老。

小写字母不同表示组间数据差异显著(P<0.05)。

2.3 马齿苋提取物对鲜切苹果PPO、POD、CAT、PAL活力的影响

PPO、POD广泛存在于植物体内，一般认为PPO在有氧条件下催化酚类物质形成邻苯醌，后经复杂的醌聚合反应形成褐色物质，这是酶促褐变发生的直接原因。马齿苋提取物处理后不同酶的活力变化见图3。由图3(a)可知，两组PPO活力在前6 d呈上升趋势，在贮藏6 d时达到最大值，而后缓慢下降，马齿苋提取物处理组PPO活力在前6 d显著低于对照组(P<0.05)，这可能是由于马齿苋提取物中含有丰富的多酚和生物碱成分，使样品具有较高的抗氧化力[19]，进而延缓鲜切苹果酶促褐变反应。由图3(b)可知，两组POD活力在整个贮藏期间表现出不断增长的趋势，但马齿苋提取物处理的鲜切苹果在2～8 d的POD活力显著低于对照组(P<0.05)，由此表明马齿苋提取物可以有效抑制POD活力的增加，延缓鲜切苹果愈伤组织形成及酶促褐变。CAT是清除自由基最重要的酶之一，CAT可分解H2O2为分子氧和水，使其组织细胞免于遭受H2O2毒害[20]。CAT属于酶促活性氧自由基清除系统中的一种，当植物受外界环境胁迫时，体内便会产生一系列信号分子激活未损伤部位远离伤害部位内抗氧化防御基因的转录与表达，提高抗氧化能力，降低自由基引起的氧化损伤，从而能够有效抑制鲜切苹果的褐变[21]。由图3(c)可知，对照组与马齿苋提取物处理组CAT活力均呈现下降的趋势，但马齿苋提取物处理组中CAT活力下降缓慢，且在整个贮藏期间马齿苋提取物处理组CAT活力显著高于对照组(P<0.05)，说明马齿苋提取物能诱导提高鲜切苹果抗氧化酶活力，减缓其氧化损伤。PAL是参与酚类物质合成的主要关键酶之一，酚类化合物的积累在一定程度上会导致PAL活力增加，促进鲜切苹果发生酶促反应。由图3(d)可知，PAL活力在前2 d达到最大值，然后缓慢下降。与对照组相比，马齿苋提取物处理组的PAL活力显著低于对照组(P<0.05)，对照组PAL活力相较初始值(0 d)增加约3倍，而马齿苋提取物处理的PAL活力较初始值(0 d)增加约2倍。可能是由于马齿苋提取物中外源酚类化合物制约鲜切苹果中束缚态酚类物质的释放，抑制活性氧的形成及各种酶活力，进而抑制鲜切苹果发生酶促褐变。

小写字母不同表示组间数据差异显著(P<0.05)。

2.4 马齿苋提取物对鲜切苹果总酚含量的影响

酚类物质作为抗氧化物质存在于水果中，一方面可以修复自身伤害，另一方面酚类物质作为PPO的底物参与酶促褐变，酚类物质的急剧下降表示酶促褐变反应加快[22]。马齿苋提取物处理后总酚含量变化见图4。在整个贮藏期间，处理组与对照组总酚含量呈现整体上升趋势，但马齿苋提取物处理鲜切苹果总酚含量增长缓慢且显著低于对照组(P<0.05)。马齿苋提取物处理能有效地抑制鲜切苹果在贮藏期间酚类物质的积累，减轻鲜切苹果的褐变程度。

小写字母不同表示组间数据差异显著(P<0.05)。

2.5 马齿苋提取物对鲜切苹果抗氧化活性的影响

DPPH自由基和羟基自由基被广泛用于园艺作物抗氧化活性的筛选，因为这些自由基被认为是脂质过氧化的有效引发剂。处理前后PPPH自由基清除率的变化见图5。两组的清除率在整个贮藏期间呈现下降的趋势，但马齿苋提取物处理组在贮藏期间自由基清除能力下降的速度较为缓慢。且DPPH自由基的清除能力在4～8 d均显著高于对照组(P<0.05)。研究表明：马齿苋提取物处理能有效减缓鲜切苹果DPPH自由基清除能力的下降，从而帮助鲜切苹果提高抗氧化能力，尽可能减少活性氧对组织产生的损伤。

小写字母不同表示组间数据差异显著(P<0.05)。

2.6 相关性分析

鲜切苹果褐变指标相关性分析见表1。表1表明，鲜切苹果在贮藏期间的褐变程度与抗坏血酸含量、CAT活力以及DPPH自由基的清除能力呈极显著负相关(P<0.01)，与MDA含量、PPO和POD活力及总酚含量呈现极显著正相关(P<0.01)，与PAL活力相关性较弱(R=0.207)。

表1 鲜切苹果褐变指标的相关性分析

3 结 论

本研究表明：质量分数0.05%马齿苋提取物处理鲜切苹果能有效保持鲜切果片的感官品质，马齿苋提取物处理有效抑制了PPO、POD以及PAL的活力，延缓CAT活力下降，且降低了总酚含量的增加，进而提高了鲜切苹果抗氧化酶活力和非酶抗氧化能力，从而降低ROS的积累，减轻氧化损伤。马齿苋提取物处理鲜切苹果贮藏第8天时，与对照组相比，POD活力降低25.36%，PPO活力降低15.56%， PAL活力降低了41.09%，MDA含量降低25.67%，CAT活力提高了86.52%，总酚含量降低了17.94%，DPPH自由基清除率提高了18.29%。与对照组相比,相关性分析也表明鲜切苹果褐变程度与抗氧化酶活力、抗坏血酸含量以及DPPH自由基清除能力呈极显著负相关(P<0.01)。马齿苋提取物处理显著延缓了MDA含量的增加，更好地保持了细胞膜的完整性，最终控制褐变的发生。因此，马齿苋提取物作为一种自然资源，是一种潜在的鲜切苹果褐变抑制剂，研究希望能进一步开拓马齿苋提取物在果蔬保鲜方面的应用。