五味子水提物抑菌活性的研究

刘月月 殷斌 林树乾 李桂明 赵增成 黄中利 傅剑 杨世发

摘要：采用水煎法制备五味子水提物（SCD），通过SCD的最小抑菌浓度、最小杀菌浓度检测和纸片扩散抑制试验评估SCD的体外抑菌活性，通过SCD对雏鸡感染大肠杆菌的治疗试验评估SCD的体内抑菌活性。结果显示，SCD对6株标准株和6株大肠杆菌分离株均具有显著的抑菌活性。SCD对雏鸡感染大肠杆菌的治疗试验结果显示，口服SCD可以显著降低感染大肠杆菌雏鸡的死亡率。这表明SCD具有良好的抑菌活性，且对环丙沙星耐药的大肠杆菌均有效，可以作为治疗细菌性疾病的备选药物。

关键词：五味子;水提物;抗菌活性;耐药大肠杆菌;SPF鸡

中图分类号：S476.8  文献标识号：A  文章编号：1001-4942（2019）08-0118-05

Abstract The aqueous extract of Schisandra chinensis （SCD） was prepared by water decoction， and the antimicrobial activity of SCD in vitro was assessed through minimal inhibitory concentration， minimal bactericidal concentration test and Kirby-Bauer zone of inhibition assay. In addition， the antimicrobial activity of SCD in vivo was tested through therapeutic effect of oral SCD on chickens infected Escherichia coli. The results showed that SCD exhibited excellent antimicrobial activity against all the six reference bacterial strains and six field E. coli strains. Therapeutic experiment found oral SCD could significantly reduce the mortality of chickens infected by E. coli. It suggested that SCD could serve as an excellent antibacterial agent for treating bacterial infections， including CIP-resistant E. coli strains.

Keywords Schisandra chinensis;Aqueous extract;Antimicrobial activity; Ciprofloxacin-resistant Escherichia coli; SPF chicken

细菌性疾病严重危害人类健康，是引起世界范围内死亡的主要原因之一。尽管在抗生素治疗方面取得进步，有效控制了传染病的流行和发生，但耐药菌的出现和增加成为一个新的问题[1]。多重耐药性细菌不仅对人类健康构成严重威胁，而且也成为兽医和畜牧业中最紧迫的问题之一[2]，对社会和经济产生了巨大影响。因此，研发新型有效的抗菌药物成为研究热点。

在中兽医上广泛应用的药用植物往往含有具有抗菌特性的生物活性成分，成为新兽药研发材料的重要来源[3-6]。最近研究发现乌梅、五味子和黄连的混合提取物对各种沙门氏菌和大肠杆菌具有抗菌作用，包括一些对多种抗生素有耐药性的菌株[7， 8]。五味子提取物可以极大减少食物中肠球菌的活菌数而不会降低食物品质，显著降低芽孢杆菌的存活率并增加其热敏感性，且对幽门螺旋杆菌也有抑制活性[9-11]，具有替代传统抗生素的可能。

本研究通过检测SCD对6株标准株、6株大肠杆菌分离株的抑菌活性和SCD对感染大肠杆菌雏鸡的治疗性试验，旨在为明确五味子的抑菌活性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

五味子，购自山东建联中药店;环丙沙星（ciprofloxacin， CIP），由中国食品药品检定研究院（NICPBP）提供，批号为130451-201502;麦康凯培养基、MH培养基、SS培养基和营养肉汤等细菌培养基，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司;药敏试纸，购自杭州天河微生物试剂有限公司;无特定病原（SPF）鸡，购自山东昊泰繁育有限责任公司。

标准菌株由NICPBP提供，分别为大肠杆菌[CMCC（B）44102]、沙门氏菌[CMCC（B）50071]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、短小芽孢杆菌[CMCC（B）63202]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]和藤黄微球菌[CMCC（B）28001]。6株大肠杆菌分离株于山东多个养殖场分离得到，标记为08-09、08-17、08-30、09-05、10-16和11-14。

1.2 五味子水提物的制备

准确称取五味子，加3倍重量蒸馏水浸泡1 h后，文火煎煮30 min，过200目筛，取上清浓缩至质量浓度为含生药1 g/mL。121℃高压灭菌15 min，4℃冰箱保存备用，用前常温放置2 h。

1.3 细菌培养

本研究共对6株标准菌株和6株大肠杆菌分离株进行抑菌试验。在无菌条件下用划线法将冷冻保存的供试菌种接于相应的固体培养基上，于37℃温箱培育18～24 h。将活化好的菌种在无菌条件下挑单个菌落接入液体培养基，37℃摇床培养18～24 h。用无菌生理盐水稀释后经麦氏比浊管比浊，制成含3 × 108 cfu/mL的菌悬液。

1.4 Kirby-Bauer（K-B）耐药性检测

K-B检测采用牛津杯法。用涂布器将试验菌均匀接种到MH平板培养基上，在无菌环境中将灭菌的牛津小杯放在培养基上，轻轻加压以确保紧密接触，移液枪吸取300 μL浓度分别为1.00、0.50、0.25 mg/mL的SCD和浓度分别为8、4 μg/mL的CIP药液注入牛津小杯，盖好陶瓷瓦盖，37℃温箱培养16～24 h后用游标卡尺测量抑菌圈直径。每种药物重复三次取平均值。

1.5 最小抑制浓度和最低杀菌浓度检测

将10 mg/mL SCD在MH肉汤中连续倍比稀释，制备11个含有SCD不同浓度系列的培养基。含8 μg/mL和4 μg/mL CIP的培养基作为药物对照组，不添加药物的培养基作为阴性对照组。用上述培养基分别对12株菌进行培养，24 h后计算SCD和CIP的最小抑制浓度（MIC），48 h后计算SCD和CIP的最低杀菌浓度（MBC）。

1.6 鸡感染大肠杆菌病理模型的构建

将300只20日龄SPF鸡随机分成6组（Ⅰ～Ⅵ）。Ⅰ～Ⅴ组为人工感染大肠杆菌08-30菌株，腹腔注射浓度分别为0.25×108、0.5×108、1× 108、2×108、4×108 cfu/mL的大肠杆菌0.2 mL。第Ⅵ组为空白对照组，注射0.2 mL生理盐水。人工感染后，观察和记录临床症状、发病时间、发病率和死亡率，并计算大肠杆菌的半数致死量，以确定大肠杆菌感染鸡模型的攻毒剂量。

1.7 体内抑菌活性的研究

将200只20日龄SPF鸡随机分为5组（Ⅰ～Ⅴ），分别为三个不同浓度SCD治疗组（Ⅰ～Ⅲ）、攻菌组（Ⅳ）和空白对照组（Ⅴ）。Ⅰ～Ⅳ组腹腔均注射0.2 mL 1×半数致死量的细菌，Ⅴ组腹腔注射0.2 mL生理盐水。攻菌后6 h，Ⅰ～Ⅲ组的鸡分别口服浓度为100、200、400 g/mL SCD 0.2 mL，连续三天，每天两次。Ⅳ组和Ⅴ组用等量生理盐水代替SCD。观察记录96 h内大肠杆菌感染相关症状、鸡的总体精神状态并计算死亡率。

1.8 统计分析

所有数据均以平均值±标准差表示。不同试验组之间的差异分析采用t检验，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌分离株的鉴定

采用生化试验对6株分离株进行鉴定，结果如表1所示。6株分离株均能发酵乳糖，吲哚和甲基红试验呈阳性，VP试验和柠檬酸盐试验均为阴性，表明6株分离株均为大肠杆菌菌株。K-B试验表明08-09菌株对CIP敏感，形成的抑菌圈平均大小为15.78 mm，其他5株菌株对环丙沙星具有高度耐药性。

2.2 SCD的抑菌活性

K-B抑制试验结果表明，SCD对12株供试菌均显示出抑菌活性（表2、表3）。在浓度为1.0 mg/mL时，SCD的抑菌圈平均直径在19.39～29.34 mm。8 μg/mL的CIP对6株标准菌株的抑菌圈平均直径为15.57～21.71 mm，5株大肠杆菌分离株对4 μg/mL和8 μg/mL的CIP均表现出高度耐药性。

2.3 SCD的最小抑制浓度和最低杀菌浓度

SCD对12株供试菌均具有抑制作用，12株菌的MIC和MBC范围分别为0.06～0.50 mg/mL和0.13～2.00 mg/mL（表4）。

2.4 SPF鸡感染大肠杆菌模型构建

鸡感染大肠杆菌后的死亡时间和死亡率结果见图1。鸡感染大肠杆菌后出现一系列相应症状，包括体温升高、精神萎靡、食欲不振、腹泻等，严重时出现死亡，空白对照组无相应症状。接种4×108 cfu/mL大肠杆菌的鸡在6 h后开始出现症状，12 h后开始死亡，在感染72 h内全部死亡。接种0.25×108 cfu/mL大肠杆菌的鸡在24 h才显示出明显症状，在试验结束时共有6例死亡。经计算，得出鸡对该株大肠杆菌的LD50为1.23×108 cfu/mL。因此，感染试验选用感染剂量为2×108 cfu/mL，使用该剂量6 h内出现明显症状，发病率为100%，死亡率约80%。

2.5 體内抑菌活性的测定

SCD在96 h内对大肠杆菌感染鸡的治疗效果如图2所示。空白对照组未见发病或死亡，单独攻菌组死亡率高达78%，口服SCD后死亡率显著降低。

3 讨论与结论

大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等是人类和畜牧生产中常发病原菌，抗生素仍是治疗细菌感染的主要选择，但多重耐药病原微生物的出现对现代医学构成了巨大威胁[2]，因此，急需开发新一代抗菌药物。五味子是一种常用中药，其水提物中含有多种生物活性物质，现已分离出30多种，并有不同程度的表征[12， 13]。药理学研究揭示这些化合物具有多种治疗效果，可抵抗多种病症，包括炎症、脂肪肝、肝炎、人类免疫缺陷病毒和焦虑等[13， 14]。

在本研究测试的致病菌中，SCD对革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌有更强的抑制作用。1.0 mg/mL SCD对细菌菌株的抗菌作用显著强于8 μg/mL CIP，且SCD对耐药性大肠杆菌的抑制作用同样显著。大肠杆菌病是家禽养殖中最常见的疫病之一，目前大肠杆菌野外分离菌株中对常规抗生素的耐药率越来越高，多重耐药菌越来越普遍[15]，对畜牧生产和人类健康构成重大威胁，开发不基于抗生素的新治疗方法具有现实紧迫性。本研究中，SCD在试验期内显著降低了相关病症的发生，提高了感染鸡的存活率。

综之，SCD在体外和体内均具有广谱抑菌活性，可作为治疗由常见病原菌引起传染病的新型高效治疗剂，但需要进一步研究、鉴定发挥作用的主要活性成分并探索潜在的分子机制。

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