两种肌萎缩侧索硬化基因表达谱差异性比较

林启鹏，朱 茜，马立伟

运动神经元病是指一类能快速进展的致死性神经变性疾病，能引起大脑皮质、脑干及脊髓运动神经元变性[1-3]。肌萎缩侧索硬化是最常见的运动神经元病，能引起患者肌萎缩、肌无力、构音障碍和呼吸衰竭，通常不伴有感觉受累。大部分肌萎缩侧索硬化患者在确诊后2～5年死亡，在美国和欧洲肌萎缩侧索硬化的发病率分别是5/10万和2/10万；其中约10%为家族性肌萎缩侧索硬化，其余均为散发性肌萎缩侧索硬化[1-3]。研究发现，利鲁唑及依达拉奉能延缓肌萎缩侧索硬化病进展，已被美国FDA批准用于治疗该病。目前尚无其他治愈方法[1-3]。

SOD1基因突变是首个被证实与肌萎缩侧索硬化疾病发生相关的基因突变位点[4]。随着对肌萎缩侧索硬化疾病的认识，越来越多的基因被发现与肌萎缩侧索硬化相关，包括SOD1、C9orf72、CHMP2B、FUS及TDP-43等[4,5]。C9orf72 和 CHMP2B突变已被证实与额颞叶痴呆及肌萎缩侧索硬化相关[6,7]；Cox等[7]发现CHMP2B突变的肌萎缩侧索硬化主要表现为下运动神经元综合征；而C9orf72突变的肌萎缩侧索硬化表现为上下运动神经元均受累[4-6]。本研究通过比较C9orf72 和 CHMP2B突变肌萎缩侧索硬化的表达谱差异来寻找用于诊断及治疗肌萎缩侧索硬化的靶点。

1 材料及方法

1.1 差异基因的分析 在GEO数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)使用“amyotrophic lateral sclerosis”进行检索，获取2个数据集(GSE68605 and GSE19332)，并从中挑选C9orf72突变及CHMP2B突变的样本。从昂飞公司官网下载基因注释文件，使用R软件(3.5.0版本)对样本进行分析[8,9]。

1.2 功能富集分析 对获得的差异基因采用在线工具DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)进行功能富集分析，获取GO分析及KEGG通路分析结果[10]。

1.3 蛋白互作网络及关键蛋白的筛选 使用在线功能STRING(http://string-db.org/)及Cytoscape 3.6.1软件进行分析及可视化蛋白互作网络[10]；使用Cytoscape 3.6.1软件中的插件cytoHubba进行关键蛋白的筛选[10,11]。

2 结 果

2.1 纳入样本信息 从GEO数据库中获得2个数据集(GSE68605 and GSE19332)，从中我们获得了11个独立样本，其中包含8个C9orf72突变型肌萎缩侧索硬化和3个CHMP2B突变肌萎缩侧索硬化。该样本的组织均来源于死后患者颈段脊髓的运动神经元。

2.2 差异基因分析 经过分析，共发现13个差异基因，其中在C9orf72突变型肌萎缩侧索硬化中表达水平上升的有CALM2、CALM1、CALM3、MT1X、RP11-480A16.1和RYR2；表达水平下降的有SLIT2、SEZ6L、SEC22B、WTAP、SAMD12、MALAT1和RAP1GDS1(图1)。

图1 两种肌萎缩侧索硬化差异基因的热点分析

2.3 差异基因功能分析 获得的13种差异基因经DAVID分析后发现仅有CALM2、CALM1、CALM3 和 RYR2能够被分类。而这些基因主要参与钙离子检测、通过调控静息态钙离子来调节心肌的收缩、调节心率、正向调节环核苷酸代谢过程及钙调通路等生物学过程。同时参与了昼夜调节、心肌细胞中的肾上腺素通路、光传导、催产素信号通路及钙信号通路等生物学通路。GO分析及KEGG分析的前10结果，见表1、2。

表1 两种肌萎缩侧索硬化差异基因的功能富集分析(GO分析)

表2 两种肌萎缩侧索硬化差异基因所涉及的生物学通路(KEGG分析)

使用STING及Cytoscape软件分析蛋白互作网络，并使用cytoHubba中的不同算法计算前10关键蛋白，结果发现在 MCC、Betweenness、BottleNeck、Closeness、Degree和EPC算法中，CALM1、CALM2和CALM3均位于前10的关键蛋白。图2展示了不同算法中的前10关键蛋白。

图2 两种肌萎缩侧索硬化cytoHubba算法计算出的前10关键蛋白

3 讨 论

本研究通过生物信息学分析C9orf72突变肌萎缩侧索硬化及CHMP2B突变肌萎缩侧索硬化的表达谱差异，从而寻找用于诊断及治疗肌萎缩侧索硬化的生物标志物及治疗靶点。分析后发现在C9orf72突变肌萎缩侧索硬化样本中有6个表达水平升高的基因及7个表达水平下降的基因。对其功能进行分析发现主要影响钙离子通路，并且CALM3、CALM2和CALM1是引起两种疾病差异的关键蛋白。

CALM1、CALM2和CALM3基因能编码钙调蛋白；钙调蛋白又被称为delta磷酸化酶激酶,它在多种生物学过程中起着重要的作用，如神经生长、代谢、细胞凋亡、肌肉收缩、细胞内运动、短期和长期记忆、以及免疫反应等[12,13]。钙调蛋白在脑及心脏中大量存在，而且在多种心脏及癌症疾病中均发现CALM基因的突变[12,13]。在心脏疾病合并有儿茶酚胺型多形性室性心动过速、长QT综合征或特发性心室颤动的患者常发现有CALM基因突变[13]。在中枢神经系统中，钙调蛋白与突触可塑性及细胞骨架重塑有关[12,14-17]。在以往报道中发现，与健康人相比，散发型肌萎缩侧索硬化患者的钙调蛋白表达水平下降，但在这些散发的患者中着重排除了SOD1、TARDBP、FUS、VCP、OPTN、UBQLN2或者C9orf72突变的患者[14]。我们发现，钙调蛋白在C9orf72突变肌萎缩侧索硬化患者中表达水平升高，其原因可能与肌萎缩侧索硬化患者上运动神经元受损相关。

本研究采用生物信息学方法分析两种类型肌萎缩侧索硬化的表达谱差异，获得可能的发病机制及治疗的靶点。但纳入样本数少，未经过体内及体外实验的验证，可能会对结果造成影响，希望将来有更多的数据可用于分析。

总之，在C9orf72突变肌萎缩侧索硬化患者中，CALM基因表达水平上调，这一关键蛋白可能是肌萎缩侧索硬化发病的重要机制，也可能是治疗该类疾病的重要靶点。