辛烯基琥珀酸淀粉- 可可精油Pickering乳液制备及稳定性研究

王艺潼， 张彦军， 徐 飞， 王 萍

(1.东北林业大学 林学院， 黑龙江 哈尔滨 150040； 2.中国热带农业科学院 香料饮料研究所/国家重要热带作物工程技术研究中心/海南省特色热带作物适宜性加工与品质控制重点实验室/海南省热带香料饮料作物工程技术研究中心， 海南 万宁 571533)

由可可粉制成的饮料作为世界三大饮料之一，在热带农业作物生产加工贸易中享有重要地位。可可树(TheobromacacaoL.)属于梧桐科(Sterculiaceae)可可属(Theobroma)，可可豆是可可树的种子且含有丰富的油脂、蛋白质及纤维等成分[1]，也是一种天然的抗氧化剂来源，含有多酚、黄酮类化合物，对心血管健康有益[2]。油脂作为可可豆最主要的成分，产率约为可可豆总量的55%，呈淡黄色[3]，室温下为乳白色固体，外观如同白蜡，具有可可特征香气，物理性质较为独特[4]，熔点在35.0～36.5 ℃，主要由棕榈酸、硬脂酸、油酸以及亚油酸等脂肪酸组成[5]。通过各种提取方法从可可豆中提取出的可可精油(cocoa essential oil, CEO)可作为天然抗氧化剂，对心脏具有保健作用，可降低血液中胆固醇、降低血糖血脂，对于人体炎性反应有抑制效果[6-7]。

Pickering乳液是一种由固体颗粒稳定的乳液，区别于传统乳液，具有稳定性高、抗Ostwald成熟、安全性好等优点，广泛应用于食品、药品和化妆品领域[8]。精油由于自身的不稳定性及易挥发性，阻碍了精油功能的利用。Pickering乳液的制备作为一种新型包埋技术，较多的应用于包埋精油，使其形成稳定乳化体系。其中辛烯基琥珀酸(octenyl succinic acid, OSA)淀粉作为一种最常见的改性淀粉颗粒被较多应用于乳液制备，淀粉进行酯化改性后具有疏水性，可以吸附在油水界面，提高乳液稳定性。Song等[9]通过研究OSA改性大米淀粉颗粒稳定的Pickering乳液发现，当淀粉质量分数为4.0%、油相体积分数为50%时可以达到长期乳液稳定。Marefati等[10]通过比较藜麦淀粉以及OSA改性后藜麦淀粉稳定的Pickering乳液发现，增加OSA取代度有助于增强乳液稳定性，减小粒径分布。Marefati等[11]通过OSA改性藜麦淀粉颗粒稳定Pickering乳液，发现其8年内具有显著的稳定性且没有聚结迹象。

已有文章对淀粉改性稳定性的研究较多，而针对OSA改性淀粉稳定的可可精油Pickering乳液稳定性的研究较少。因此，本研究选取可可精油(CEO)作为油相，利用GC- MS测定其内部脂肪酸成分，并以OSA淀粉作为固体颗粒稳定可可精油制备的Pickering乳液，通过改变淀粉质量浓度以及精油体积分数，探究乳液粒径变化趋势。通过微观结构观察、傅里叶红外光谱结构分析对乳液形成状态以及界面形成方式进行研究，探究不同环境条件对乳液稳定性的影响，以期为后续精油及其乳液高效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

可可，中国热带农业科学院香料饮料研究所(2020年3月)；辛烯基琥珀酸淀粉，源叶生物科技有限公司；尼罗红、尼罗蓝，上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HA640- 70- 27- C(2)型超临界CO2萃取装置，江苏南通华安超临界萃取有限公司；FJ200- SH型数显高速分散均质机，上海标本模型厂；JY92- 2D型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；AL104型电子天平，梅特勒- 托利多仪器(上海)有限公司；Cascada III.I 10型超纯水系统，美国PALL公司；BX51型正立荧光显微镜、FV10i型激光共聚焦显微镜，日本奥林巴斯公司；Prox型台式显微能谱一体机，荷兰Phenom公司；GT SONIC- T20型超声波清洗机，广东固特超声股份有限公司；MB45型奥豪斯快速水分测定仪，奥豪斯仪器上海有限公司；7890A- 5975C型气相色谱质谱联用仪，美国安捷伦有限公司；MasterSizer 3000型粒径分析仪，英国Malvern公司。

1.3 实验方法

1.3.1可可精油提取

采用超临界CO2萃取法提取可可精油。将干燥可可豆粉碎、过筛，得到可可粉，放置烘箱内将水分含量降低至6%，保存备用。准确称取500 g可可粉，放置于萃取釜中，设置萃取加热温度35 ℃，分离加热温度36 ℃，CO2流速68.5 km/h，萃取釜、分离釜Ⅰ、分离釜Ⅱ压力分别为29、10、4 MPa，多次提取得到可可精油。

1.3.2可可精油脂肪酸组成分析

1.3.2.1 脂肪酸甲酯化

取1 mL可可精油于250 mL磨口锥形瓶中，加入质量分数2%的氢氧化钠- 甲醇溶液，80 ℃水浴冷却回流1 h，直至油滴消失。加入7 mL质量分数15%的三氟化硼- 甲醇溶液，继续回流2 min，清洗回流管，取下烧瓶冷却至室温。加20 mL正庚烷，振摇2 min，再加饱和氯化钠水溶液，静置分层。吸取上层5 mL正庚烷提取物至25 mL具塞试管中，加入约4 g无水硫酸钠，振摇1 min，静置5 min，吸取上层液体测定脂肪酸组成。

1.3.2.2 脂肪酸含量的GC- MS分析

可可精油脂肪酸分析按照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的测定》[12]进行分析。色谱条件：色谱柱DM- 2560(100 m×0.25 mm×0.2 μm)。进样器进样温度240 ℃，检测温度280 ℃，升温程序为初始温度100 ℃，保持13 min；10 ℃/min升温至180 ℃，保持6 min；继续以1 ℃/min升温至200 ℃，保持20 min；最后以4 ℃/min升温至230 ℃，保持10.5 min。载气为Ne，不分流进样，开阀时间60 s。

电子轰击(EI)离子源，电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，MS 四极杆温度150 ℃，质量扫描范围40～450，溶剂延迟4 min，检测模式为全扫描模式。所得图谱经计算机谱库(NIST 14)检索，用色谱峰面积归一化法测定各脂肪酸的相对含量。

1.3.3可可精油Pickering乳液制备

准确称取一定质量OSA淀粉，按照一定比例加入去离子水，在85 ℃下充分搅拌0.5 h后，冷却降温至50 ℃，制备的淀粉质量浓度分别为50、100、150、200、250、300 mg/mL。按照一定比例量取可可精油，逐滴加入到一定质量浓度的OSA淀粉溶液中，使最终总体积为10 mL，油相体积分数梯度设置为5%、10%、15%、20%、25%、30%。在相同温度条件下，剪切搅拌3 min，转速为10 000 r/min制备初乳液。在超声功率375 W条件下将初乳液超声4 min，得到可可精油Pickering乳液。

1.3.4可可精油Pickering乳液表征

1.3.4.1 粒径测定

取适量可可精油Pickering乳液，用蒸馏水稀释100倍后，室温(25±1) ℃下以马尔文激光粒度仪测定其平均粒径。折射率分别为1.46和1.33，每个样品测定9次，每次间隔10 s。

1.3.4.2 微观结构观察

1)光学显微镜观察。取10 μL乳液滴至载玻片，盖上盖玻片，使用正立荧光显微镜放大100 倍进行观察，以评估液滴大小以及聚集状态。

2)激光共聚焦显微镜观察。将2 mL乳液样品加入离心管中，用50 μL 质量分数为0.1%的尼罗红和50 μL质量分数为0.1%尼罗蓝染色，混合均匀5 min，避光保存2 h后测定。尼罗红与尼罗蓝分别选取488 nm与633 nm波长下测定，由氦氖(He- Ne)激光激发[13]。

3)扫描电镜观察。先将Pickering乳液进行喷雾干燥制备成粉末后，再通过扫描电镜观察表面形态。喷雾干燥条件：进口温度为140 ℃，出口温度为85 ℃，抽气速率为100%，蠕动泵温度为40 ℃，进料流速为600 L/h，自动喷嘴清洗6次。将干燥后的粉末固定在具有双面胶的金属棒上，经过喷金后，在扫描电镜上以10 kV的加速电压观察。

1.3.4.3 红外光谱分析

将可可精油Pickering 乳液、OSA淀粉以及CEO，分别进行傅里叶红外光谱分析，在室温条件下采用压片法测定。取干燥后的KBr粉末，研磨后放置压片机中制备成一定直径及厚度的透明片，分别将相同体积的精油、淀粉乳以及Pickering乳液涂抹至光滑表面，放至仪器光束中测定。使用400～4 000 cm-1的区域进行扫描，分辨率为4 cm-1，总共扫描64次。

1.3.4.4 Pickering乳液稳定性测定

1)pH稳定性。将乳液置于50 mL离心管中，利用HCl或NaOH将乳液pH值调至2～8，并用锡纸包裹试管放置暗处6 h，将乳液稀释50倍后分别测定其zeta电位及粒径变化趋势[14]。

2) 盐离子稳定性。将适量的NaCl粉末直接加入到新制备的乳液中，浓度为0.1～0.5 mol/L，用锡纸包裹试管并将其放置暗处6 h。观察是否分层，测定乳液粒径变化趋势[15]。

3) 贮藏稳定性。不同淀粉质量浓度以及不同精油体积分数制备的Pickering乳液在室温(25±1) ℃，避光条件下静置21 d，分别在1、3、5、7、14、21 d取样，测定粒径变化趋势。

1.4 数据处理

所有实验均进行3次重复，数据最后以平均值±标准差表示。采用SPSS 21.0.1中的单因素分析方法对实验中数据进行显著性分析，P<0.05 为显著相关，采用Origin 2019软件绘图。

2 结果与分析

2.1 可可精油主要脂肪酸成分分析

可可精油中主要脂肪酸组成见图1和表1。由图1和表1可知，可可精油中主要分离鉴定出6种脂肪酸，主要成分为饱和脂肪酸，占总脂肪酸质量分数的64.675%，不饱和脂肪酸质量分数为35.325%。6种脂肪酸中硬脂酸含量最高，占总脂肪酸的37.914%。十七烷酸、花生酸含量均低于1.000%。Jia等[16]研究表明：可可精油是由棕榈酸(21.7%～27.0%)、硬脂酸(30.6%～39.2%)和油酸(29.4%～35.4%)等脂肪酸构成，亚油酸为2.2%～3.4%，花生酸约占2.0%。本研究所用可可精油的简单脂肪酸均与Jia等[16]的测定结果类似，而亚油酸与花生酸含量差异归因于原料、产地等的不同。

图1 可可精油脂肪酸总离子流色谱

表1 可可精油的主要脂肪酸

2.2 可可精油Pickering乳液制备工艺优化及结构表征

2.2.1淀粉质量浓度对乳液粒径的影响

不同淀粉颗粒质量浓度制备的乳液中，当颗粒质量浓度增加时，乳液液滴尺寸减小，直至达到一个基本恒定值，表明到达全覆盖条件[17]。不同淀粉质量浓度与乳液粒径大小及分布的关系见图2。图2(a)为不同OSA淀粉颗粒质量浓度制备的可可精油Pickering乳液的D4,3变化趋势。

图2 淀粉质量浓度与乳液粒径大小及分布的关系

由图2(b)可知，当油相体积分数为5%时，随着OSA淀粉颗粒质量浓度增加，乳液粒径逐渐减小且分布越来越集中、均匀。当颗粒质量浓度为50 mg/mL时，粒径分布出现双峰，分布范围为0.576～2.820 μm，这与Li等[18]实验结果一致。本研究产生双峰的原因在于乳液中同时存在着均匀且颗粒较小的液滴以及通过聚集产生的大液滴。当颗粒质量浓度为100 mg/mL时，粒径分布双峰消失、范围增大，分布范围向左偏移，粒径尺寸范围为0.577～2.540 μm。而后，随着淀粉颗粒质量浓度继续增加，粒径尺寸降低，此时空间位阻变大，液滴聚集率降低。颗粒质量浓度大于200 mg/mL时，再次出现双峰，此时较小的峰是由多余的游离淀粉产生。当颗粒质量浓度为250 mg/mL时，粒径尺寸达到最低，D4,3为(0.796±0.004) μm。根据陆兰芳等[19]实验结果，本研究产生此现象的原因可能是此时淀粉颗粒稳定界面层较为稳定，更多颗粒在油滴表面附着，形成更致密的网络结构。当淀粉颗粒质量浓度达300 mg/mL后，乳液体积密度逐渐增大，淀粉颗粒在液滴表面覆盖厚度增加，反而增加了乳液粒径。

表2为不同淀粉质量浓度制备的乳液液滴尺寸分布，同样表明，随着淀粉颗粒质量浓度的增加，液滴尺寸(D50、D60和D90)逐渐减小。当淀粉颗粒质量浓度高于200 mg/mL时，液滴尺寸保持普遍稳定；且质量浓度250 mg/mL时，粒度最小。

表2 不同淀粉质量浓度制备的乳液液滴尺寸分布

2.2.2精油体积分数对乳液粒径的影响

图3为不同精油体积分数与乳液粒径及分布的关系。由图3(a)可知，随着精油体积分数增加，乳液粒径逐渐增大，当精油体积分数到达一定程度时，OSA淀粉颗粒不足以完全覆盖液滴表面，使乳液稳定性变差，从而产生油相外析的破乳现象。

图3 精油体积分数与乳液粒径大小及分布的关系

由图3(b)可知，随着可可精油体积分数的增加，单位体积内乳液的含油量增加，液滴粒径尺寸增大，表面覆盖OSA淀粉层变薄，无法形成致密的稳定吸附层，液滴之间的相互作用促进了聚集。当精油体积分数为10%时，OSA淀粉可以完全覆盖油滴表面，形成稳定的界面结构。固定淀粉质量浓度250 mg/mL，精油体积分数10%时，乳液粒径增长幅度比5%时小，说明在此精油体积分数下，单位体积的液滴中可以包裹更多精油且粒径尺寸保持相对稳定。当精油体积分数上升至15%以上时，粒径分布出现明显双峰；并随着精油体积分数的升高，后峰峰值逐渐增大，说明质量浓度为250 mg/mL的淀粉颗粒在形成相对较小液滴的同时，剩余颗粒为将精油完全包裹，从而形成了较大液滴颗粒，同时淀粉颗粒可能倾向于聚集后产生较大尺寸的团聚块。当精油体积分数为30%时，后峰体积分布大于前峰，粒径分布范围为0.675～5.820 μm。

表3为不同精油体积分数制备Pickering乳液液滴尺寸分布。结果表明：精油体积分数为5%与10%时，乳液的D50和D60变化较小，但D90具有较大差异，说明淀粉质量浓度250 mg/mL时可以形成大量小液滴且液滴粒径分布均匀。本研究中淀粉颗粒质量浓度高于150 mg/mL时，乳液液滴粒径成阶梯状逐渐升高，推断这可能与逐渐增加的精油体积分数有关[20]。精油添加量越高，乳液之间混合效率越低，从而导致更宽的粒径分布，以至于产生双峰分布状态，而在精油体积分数30%时粒径达到最大值。

表3 不同精油体积分数制备的乳液液滴尺寸分布

2.2.3红外光谱分析结果

OSA淀粉、CEO以及Pickering乳液的红外光谱如图4。

图4 OSA淀粉、CEO、乳液结构光谱

2.2.4微观结构分析

图5为Pickering乳液光学显微镜下的粒径分布。由图5可知，在100倍显微镜下观察到乳液呈小液滴状态，液滴大小均一且分布均匀。同时从粒径分布趋势也可以看出，乳液粒径基本呈正态分布，右侧小峰值产生归因于小液滴聚集，分布范围较小，粒径大小主要集中在0.464～1.150 μm，平均粒径D4,3为(0.783±0.021) μm。

图5 Pickering乳液光学显微镜下粒径分布

图6为Pickering乳液激光共聚焦图。图6(a)为乳液液滴颗粒荧光局部图，其中油相信号设置为红色，淀粉信号设置为绿色。由图6(a)可以清晰看出油滴被淀粉紧密包裹，说明形成了稳定的颗粒包合结构，同时印证红外光谱分析结果，两相可能由于静电相互吸引作用来稳定液滴表面。乳液液滴较小，可以观察到2个液滴相互聚集现象，其间由淀粉连接，这说明粒子之间可以由表面淀粉相互作用连接产生聚集。本研究中可能是在单独均匀分布的液滴颗粒表面形成单层结构，淀粉溶液充满精油表面以及油滴之间，形成相互连接桥梁，使乳液稳定[26]。图6(b)为乳液液滴放大后荧光显微镜图，放大后可以更明显地看出油滴外部由一圈淀粉环包裹，液滴整体圆滑均匀，证明此时可可精油Pickering乳液体系稳定且均一。

图6 Pickering乳液激光共聚焦图

OSA淀粉及乳液扫描电镜图见图7。由图7(a)可知，淀粉颗粒大小不均一且存在球形和不规则形状。图7(b)为经喷雾干燥后的乳液颗粒，此时颗粒密度较大，连接较为紧密，单位面积内的固体颗粒大小较为均匀，但形态不规则，表面有较多褶皱。此研究结果产生的原因可能是喷雾干燥法对颗粒形态产生了较大影响，液滴在喷干过程中发生聚集，加热过程水分快速蒸发，造成颗粒表面出现收缩现象[27]。结合粒径测量结果发现：扫描电镜观察到经过喷雾干燥后的乳液液滴粒径增大，原因可能与喷雾干燥后颗粒聚集相关。理想状态下喷雾干燥的颗粒表面为光滑圆球，根据Zhou等[28]研究结果，本研究由于颗粒乳化能力、OSA淀粉性质以及工艺参数的差异导致颗粒形态各异。由喷雾干燥制备的颗粒只有少数表面较为光滑平整，大部分表面出现凹陷、褶皱，但无明显裂痕，如图7(c)，说明CEO被很好地包裹至淀粉中。这与柳艳梅[29]制备OSA- 壳聚糖双层乳液实验结果相似。

图7 OSA淀粉及Pickering乳液扫描电镜

2.3 可可精油Pickering乳液稳定性分析

2.3.1pH值对乳液稳定性的影响

图8为pH值对乳液粒径及zeta电位的影响。随着pH值的增加，粒径呈逐渐增大的趋势，电位绝对值呈现先增大后减小的趋势。在低pH值(2～5)时，乳液液滴粒径尺寸保持相对较小；相比于新鲜制备的Pickering乳液(pH值为5)，pH值降低时粒径尺寸变小，电位绝对值增大，颗粒之间电荷相互作用较强，颗粒不易聚集。随着pH值的升高(6～8)，粒径尺寸突增后保持稳定，电位绝对值逐渐减小。根据张琳琳等[30]实验结果分析本研究产生此现象的原因可能是体系的pH值改变，导致了液滴表面电荷以及界面结构的变化，从而影响了颗粒之间的静电相互作用，降低了颗粒之间的紧密联结程度，最后影响乳液稳定性，表现为乳液粒径的增大和电位绝对值降低。pH值 5左右时为酸性环境，带有负电荷的淀粉颗粒之间静电力显著增加，此时液滴之间不易聚集，虽然粒径略有增加，但变化不明显，此时电位绝对值处于最大值，可以形成较为稳定的乳液体系。pH值在6及以上时，OSA淀粉稳定的乳液体系变得不稳定，粒径显著增加且电位绝对值降低。液滴相互聚集、粒径增大的原因可能是界面带电量降低，淀粉颗粒之间没有足够的静电力稳定乳液[31]。研究表明，pH值5时，乳液处于相对稳定状态。

图8 pH值对Pickering乳液粒径以及zeta电位的影响

2.3.2盐离子浓度对乳液稳定性的影响

盐离子浓度对Pickering乳液粒径的影响见图9。由图9可以看出，随着盐离子浓度增加，乳液粒径呈现逐渐增大的趋势。乳液在低离子浓度(0～0.3 mol/L)下，内部静电斥力较为稳定，粒子彼此间的相互作用力有效地防止了聚集，提高了液滴颗粒大小的均一性，防止乳液稳定性变差。高离子浓度(0.3～0.5 mol/L)作用下，排斥作用强度小于粒子间相互吸引力，这可能是造成乳液液滴聚集和粒径增长的原因[15]。通过粒径测量发现，高离子浓度下的乳液内部不稳定，多次测定结果产生较大误差，这是由于加入过量盐离子后，产生静电屏蔽效应，液滴之间的静电斥力以及空间位阻都会减少，乳液稳定性降低，内部均一性变差，这与Li等[32]实验结果相同。

图9 盐离子浓度对Pickering乳液粒径的影响

2.3.3贮藏时间对乳液稳定性的影响

图10(a)为不同淀粉质量浓度下制备的可可精油Pickering乳液贮藏过程中粒径的变化。随着贮藏时间的增加，乳液粒径依旧保持随淀粉质量浓度增加，粒径减小的趋势。其中，3 d时的50 mg/mL淀粉颗粒稳定的乳液粒径急剧增大，现象产生的原因可能是小液滴出现聚集状态，相互融合形成大液滴[33]，说明体系内部不稳定；还可能是由于Ostwald成熟过程，即较小的液滴逐渐聚集增大为较大液滴，直至小液滴消失的过程，此时粒径由1.500 μm增长至1.890 μm。而3 d后各淀粉质量浓度制备的乳液粒径保持平稳增长。至14 d时，50～200 mg/mL淀粉质量浓度下的乳液粒径增长约0.500 μm，21 d时粒径最大达2.760 μm;相反淀粉质量浓度250 mg/mL以上的乳液保持相对稳定状态且乳液均匀未出现分层现象。

图10 不同贮藏时间对乳液粒径的影响

图10(b)为不同CEO体积分数制备的Pickering乳液贮藏过程中粒径的变化。随着贮藏时间的增加，乳液粒径呈现逐渐增大趋势且在CEO体积分数为30%时，具有最大粒径，3.760 μm，同时乳液出现分层。当精油体积分数5%时，乳液在前7 d均保持稳定且粒径变化不明显，这是由于质量浓度为250 mg/mL的淀粉颗粒可以完全包裹住油滴，颗粒之间紧密衔接，将精油分散包裹成小液滴。而7 d后的乳液粒径突然增大，这是由于淀粉颗粒与颗粒之间的相互碰撞增加了液滴聚集的可能，淀粉分子之间的相互作用也可以吸引液滴相互聚集，造成乳液粒径增大[34]，这也是不同精油体积分数制备的Pickering乳液粒径随贮藏时间延长而增大的主要原因。

3 结 论

利用OSA淀粉作为固体颗粒稳定剂，稳定以CEO为油相的Pickering乳液。形成的乳液液滴呈球形，淀粉质量浓度为250 mg/mL且精油体积分数为10%时，粒径为0.780 μm左右。通过光学显微镜、扫描电镜以及激光共聚焦荧光显微镜证明乳液油水界面表面光滑，傅里叶红外光谱分析结果表明形成的乳液内部并没有新的化学键生成，说明淀粉与精油之间可能存在其他相互作用。向乳液中添加离子浓度大于0.3 mol/L的NaCl时，粒径尺寸呈急速上升趋势，此时乳液极不稳定；pH值在5左右时，乳液相对稳定；通过21 d贮藏稳定性分析不同淀粉质量浓度和精油体积分数制备的乳液的粒径变化，表明乳液粒径随时间增加均变大，但相同贮藏时间下，随着淀粉质量浓度增加，乳液粒径减小，而精油体积分数增加导致乳液粒径增大。