丹参醇提物的抗菌作用研究

陈 颖

(商洛学院 健康管理学院，陕西 商洛 726000)

丹参是唇形科鼠尾草属，其药用部位为干燥根及根茎。其味苦，微寒，归心、肝经。具活血祛瘀、清心除烦、凉血消痈和通经止痛等作用[1]。丹参作为我国常用大宗药材之一，在治疗心血管疾病方面作用显著[2]。丹参的脂溶性成分大多为共轭醌、酮类化合物，主要包括：隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡB，丹参酮ⅡA，等。其中丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量较高[3]，其脂溶性丹参酮类具有抗菌、血液循环及消炎等作用[4]，并且隐丹参酮是丹参抗菌的主要有效成分。

近几年来，细菌耐药性问题层出不穷，严重影响大家的身体健康。虽然有很多科学家投身于解决细菌耐药性的问题，但还没有发现一个从根本上能够解决细菌耐药性问题的方法[5]。随着对细菌耐药性的深入研究，人们发现可从天然产物途径来发现能抗菌的成分[6]，特别是从一些药用植物中探索能够抑制抗生素耐药菌的化合物[7]。又有研究发现，细菌不容易对中草药产生耐药性，而且我们国家自古以来就拥有十分丰富中草药资源[8]。由此可看，从中药中提取新型抑菌剂，或者与抗生素联合使用，具有广泛的应用前景和临床研究价值。

1 材料与方法

1.1 丹参醇溶性成分的提取

将丹参的干燥根及根茎，粉碎，过60目筛，称取100 g，倒入1 000 mL烧杯中，加入500 mL无水乙醇，超声提取60 min，提取液抽滤。将滤液放入旋转蒸发仪中蒸发，至旋干后，倒入一定量的无水乙醇将丹参的醇溶性成分溶解完全，移至带盖小试管中，计算其浓度。密封保存待用。

1.2 丹参醇提物对细菌的生物量影响

首先，在50 mL的具塞试管中加入40 mL的液体培养基，再加入不同浓度的提取液，使提取物的最终浓度为0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.125、0.25、0.4、0.5 mg·mL-1，每瓶接入4 mm直径菌饼两块。然后在振荡器中37℃震荡培养，每个浓度重复两遍。震荡培养7 d后抽滤收集菌丝体，用蒸馏水冲洗3次，称量菌体湿重。然后将菌丝置于80 ℃烘箱中干燥2 h，称量菌体干重。

空白组：因提取物的溶剂是无水乙醇，以防其对细菌有一定的抑菌效果，影响实验结果。实验分2个空白组(一组是用无水乙醇做空白对照，一组是用无菌水做空白对照)，来观察实验结果。

无水乙醇空白：含有等量无水乙醇的培养基，每瓶接入4 mm直径菌饼2块，同上。

水空白：含有等量水的培养基，每瓶接入4 mm直径菌饼2块，同上。

每种菌的操作步骤同上。

1.3 丹参醇提物的体外抑菌活性研究

板1测定丹参醇提物对五种菌的最小抑菌浓度。在96孔细胞培养板A行第一个孔加入160 μL液体培养基，第12孔加200 μL液体培养基，第2～11孔各加100 μL液体培养基。然后，给第一孔加40 μL已知浓度的丹参醇提物后用移液枪充分吹打(至少三次以上)，使药物与液体培养基充分混匀，然后从第一孔吸取100 μL加入第二孔再充分吹打使之与培养基充分混匀，照此重复至第11孔，吸取100 μL弃去。此时，再给1-11孔加入100 μL移培养好的MRSA1。B-E行同上，最后一步加不同的细菌培养液，分别是加肺炎克雷伯菌、MRSA2、铜绿假单胞菌和伤寒杆菌。

板2～6测定丹参醇提物与抗生素联合对受试菌的最小抑菌浓度。在96孔细胞培养版的第一列加入140 μL的液体培养基和20 μL丹参醇提物，第12列加200 μL的液体培养基。第2-11列加90 μL液体培养基和10 μL丹参醇提物。A-H行第一孔分别加40 μL八种不同抗生素，用移液枪充分吹打(至少三次以上)，使充分混匀。然后从第一孔吸取100 μL加入到第二孔再充分吹打使之与培养基充分混匀，照此重复至第11孔，吸取100 μL弃去。最后给1～11列每个孔加100 μL细菌培养液。

板7～11测定抗生素本身对受试菌的最小抑菌浓度。在96孔细胞培养版的第一列加入160 μL的液体培养基，第12列加200 μL的液体培养基。第2～11列加100 uL液体培养基。A～H行第一孔分别加40 μL八种不同抗生素，用移液枪充分吹打(至少三次以上)，使充分混匀。然后从第一孔吸取100 μL加入第二孔再充分吹打使之与培养基充分混匀，照此重复至第11孔，吸取100 μL弃去。最后给1～11列每个孔加100 μL细菌培养液。

2 结果分析

2.1 丹参醇提物对五种抗生素耐药菌的生物量影响结果

液体培养基培养下，丹参醇提物在7 d内对5种抗生素耐药菌生物量的影响见表1～6。

由表1中数据可知，供试的丹参醇提液在0.1 mg·mL-1时，7 d内MRSA1的菌丝生物量减少了一半左右，其余浓度供试液对MRSA1的菌丝生物量没有影响。

表1 不同浓度丹参醇提物对MRSA1菌丝湿重和干重的影响

由表2中数据分析得供试的丹参醇提液浓度在0.06 mg·mL-1时，对伤寒杆菌的抑菌效果最佳，其余浓度供试液对伤寒杆菌菌丝的生物量没有影响。

表2 不同浓度丹参醇提物对伤寒杆菌菌丝湿重和干重的影响

由表3中数据分析得供试的丹参醇提液浓度在0.04 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1时，对肺炎克雷伯菌的菌丝生物量均有控制效果，总体来讲，浓度愈高，控制效果愈好。其中浓度处于0.5 mg·mL-1时控制效果最佳，肺炎克雷伯菌的菌丝生物量减少13倍左右；浓度处于0.1 mg·mL-1和0.25 mg·mL-1时，其对肺炎克雷伯菌的菌丝生物量控制效果相差无几，菌丝生物量减少2/3左右；浓度处于0.04 mg·mL-1时，肺炎克雷伯菌的菌丝生物量减少一半左右。

表3 不同浓度丹参醇提物对肺炎克雷伯菌菌丝湿重和干重的影响

由表4中数据分析得供试的丹参醇提液各浓度浓度，对MRSA2菌丝生物量均没有明显控制作用。

表4 不同浓度丹参醇提物对MRSA2菌丝湿重和干重的影响

由表5中数据分析得供试的丹参醇提液各浓度在对铜绿假单胞菌的菌丝生 物量均没有明显控制作用，在0.06 mg·mL-1时，稍有控制作用。

表5 不同浓度丹参醇提物对铜绿假单胞菌菌丝湿重和干重的影响

2.2 丹参醇提物的体外抗菌活性研究

将丹参醇提物单独用药时，所测得的MIC值如表6所示：所得结果与之前菌丝生物量控制效果几近相同，即丹参醇提物单独用药时，对五种临床菌在2 560 mg·mL-1的浓度下均没有明显抗菌效果。

为了更好的研究丹参醇提物的抑菌活性，本研究将其与抗生素联用作用于五种临床菌，其结果如表6所示：

表6 丹参醇提物单独用药的MIC值

由表7中数据可知：丹参醇提物与青霉素、头孢唑啉钠、卡那霉素、四环素、氯霉素、红霉素联合对MRSA1没有抑菌效果；丹参醇提物与头孢噻肟钠联合对MRSA1的最小抑菌浓度是3 840 μg·mL-1；丹参醇提物与诺氟沙星联合对MRSA1的最小抑菌浓度是960 μg·mL-1。

表7 丹参醇提物与抗生素联合对MRSA1的最小抑菌浓度

由表8中数据可知：丹参醇提物与青霉素、卡那霉素、氯霉素联合对肺炎克雷伯菌没有抑菌效果；丹参醇提物与头孢唑啉钠联合对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度是1 920 μg·mL-1；丹参醇提物与头孢噻肟钠联合对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度是240 μg·mL-1；丹参醇提物与四环素联合对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度是480 μg·mL-1；丹参醇提物与诺氟沙星联合对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度是240 μg·mL-1；丹参醇提物与红霉素联合对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度是3 840 μg·mL-1。

表8 丹参物与抗生素联合对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度

由表9中数据可知：丹参醇提物与青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素联合对MRSA2没有抑菌效果；丹参醇提物与头孢唑啉钠联合对MRSA2的最小抑菌浓度是960 μg·mL-1；丹参醇提物与头孢噻肟钠联合对MRSA2的最小抑菌浓度是240 μg·mL-1；丹参醇提物与诺氟沙星联合对MRSA2的最小抑菌浓度是120 μg·mL-1；丹参醇提物与氯霉素联合对MRSA2的最小抑菌浓度是1 920 μg·mL-1。

表9 丹参醇提物与抗生素联合对MRSA2的最小抑菌浓度

由表10中数据可知：丹参醇提物与青霉素、头孢唑啉钠、头孢噻肟钠、卡那霉素、四环素、氯霉素、红霉素联合对铜绿假单胞菌没有抑菌效果；丹参醇提物与诺氟沙星联合对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度是240 μg·mL-1。

表10 丹参醇提物与抗生素联合对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度

由表11中数据可知：丹参醇提物与氯霉素、四环素、头孢唑林钠青霉素、红霉素联合对伤寒杆菌没有抑菌效果；丹参醇提物与头孢噻肟钠联合对伤寒杆菌的最小抑菌浓度是960 μg·mL-1；丹参醇提物与卡那霉素联合对伤寒杆菌的最小抑菌浓度是1 920 μg·mL-1；丹参醇提物与诺氟沙星联合对伤寒杆菌的最小抑菌浓度是60 μg·mL-1。

表11 丹参醇提物与抗生素联合对伤寒杆菌的最小抑菌浓度

3 讨论与结论

丹参醇提液浓度在0.06 mg·mL-1时，对伤寒杆菌的菌丝生长量有一定抑制影响，浓度在0.04 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1时，对肺炎克雷伯菌的菌丝生物量均有控制效果，且浓度愈高，控制效果愈好，其中浓度处于0.5 mg·mL-1时控制效果最佳，肺炎克雷伯菌的菌丝生物量减少13倍左右。在体外抑菌效果研究中，虽然丹参醇提物单独用药抑菌效果不佳，但是与其他抗生素连用均展现不同抑菌效果，尤其展现了其对肺炎克雷伯菌的抑菌效果，其中与头孢噻肟钠连用，使抑菌效果提高了6倍。

本课题通过测定菌丝生物量的方法，观察到液体培养基培养下，丹参醇提物在7 d内对5种临床常用生物量的影响。分析实验结果得出丹参醇提物有一定的抑菌活性并得到最佳抑菌浓度。采用微量稀释法测定丹参醇提物与八种抗生素联合对五种菌的最小抑菌浓度。本课题只是对新型抑菌剂方面进行小小的一点探索，后续的研究中还需更加全面系统的对其进行研究，为新型抑菌剂方面提供有力的理论依据。