一株海洋源长枝木霉菌ST-27的发酵产物对无乳链球菌的抑制作用研究

苏艳君，郑诗婷，吴 鹏，唐 旭*

1厦门医学院附属口腔医院，厦门 361006；2自然资源部第三海洋研究所 海洋生物资源开发利用工程技术创新中心，厦门 361005

无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)也称B族链球菌，是能引起人和动物很多疾病的病原菌，在健康成年人的下消化道和泌尿生殖道大约有15%～30%的定殖率，当人体免疫低下或缺陷时易发生无乳链球菌感染从而引发尿路感染、皮肤软组织等感染，导致孕妇发生早产、胎膜早破、死胎等各种不良妊娠结局及新生儿败血症和脑膜炎等严重的新生儿感染疾病[1-3]。2010年美国疾病控制与预防中心(CDC)推荐青霉素作为非青霉素过敏孕妇及新生儿无乳链球菌感染的首选治疗用药，青霉素过敏的人群使用大环内酯类抗生素红霉素和(或)林可酰胺类抗生素克林霉素[4]。Zhou等[5]分析了不同类型无乳链球菌感染新生儿的临床特点及其对药物的敏感情况，早发型无乳链球菌感染与晚发型无乳链球菌感染具有不同的临床特点，建议临床应根据无乳链球菌药敏结果合理选用敏感率较高的抗菌药物(青霉素、万古霉素、氨苄西林和美罗培南)治疗，避免使用耐药率较高的药物。Liu等[6]针对围产期妇女产前无乳链球菌感染情况及药物敏感性开展研究，发现无乳链球菌在围产期妇女阴道分泌物检出率达4.74%，β-内酰胺类无耐药，但青霉素敏感度有下降表现。综上所述，目前临床上对无乳链球菌病的防治主要采用抗生素治疗手段，然而随着抗生素的大量使用，使无乳链球菌的耐药性增强[7]，例如克林霉素与红霉素以前曾作为治疗无乳链球菌的二线药物，现国内外均有研究报道其耐药率逐年上升[8,9]，并且国内耐药率一直显著高于国外[10,11]。因此，使用生物手段，利用新型生物活性物质以应对病原菌及其耐药性的增强成为当前医药界的迫切需要。Lu等[12]以微生态防控的角度寻找水生动物无乳链球菌病的防治方法，他们以21株芽孢杆菌Baciclus作为来源菌株，筛选出一株对无乳链球菌有较强抑制作用的菌株BA015，发现该菌株及其去菌体发酵液对无乳链球菌病的防治存在潜在应用价值。

木霉属真菌广泛分布于世界各地，种类十分丰富。木霉菌及其代谢产物对多种病原菌有很强的抑制作用，与化学抗生素相比，具有天然、无毒、无污染的特点，因此以木霉及其代谢产物为基础的生物抗生素成为研究热点。截止目前，从木霉菌中分离得到有抑菌效果的代谢物有140余种，例如木霉素、绿粘帚霉素、绿胶霉素等[13,14]。海洋来源微生物已经成为分离新的活性代谢产物的重要资源，尤其是海洋来源真菌具有产次级代谢产物巨大潜能，其次级代谢产物大多具有较好的生物活性，包括抗菌、抗肿瘤活性等[15]。相比陆地环境中被分离和鉴定的真菌，海洋环境中的真菌很少被分离和鉴定[16,17]。海洋作为一个复杂多变的生态系统，具有不同于陆地的高压、高盐、低温、寡营养等特殊性，这些因素使海洋微生物易产生不同于陆源生物且具有特殊功能的活性物质。因此，从海洋源微生物中寻找具有功效特异、结构新颖的生物活性物质的概率更大，是研究开发新型生物活性物质的重要资源[18]。木霉菌是一种重要的生防菌，近年来国内外对其展开了大量的研究。本文自海洋底栖动物海绵中筛选获得一株抗革兰氏阳性菌的长枝木霉ST-27，对其发酵产物抗无乳链球菌的性能进行了初步研究，为新型生物抑菌剂的开发提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

本文所用长枝木霉菌ST-27由自然资源部第三海洋研究所海洋生物资源开发利用工程技术创新中心实验室分离自海绵并保藏；无乳链球菌标准菌株ATCC12386和CMCC(B)32116购自广东省微生物菌种保藏中心。

长枝木霉ST-27的培养基配方：PDB液态培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、H2O 1 000 mL，pH 5.2±0.2；PDA固态培养基：24 g PDB培养基、琼脂糖12 g、H2O 1 000 mL，pH 5.2±0.2；FS1培养基：大米100 g、玉米面0.15 g、大豆蛋白胨0.45 g、海盐1.5 g、H2O 120 mL，详细配制方法为：玉米面、蛋白胨先用1.5%海盐水加热溶解，然后和大米一起用电饭煲蒸约40 min，分装到1 L锥形瓶中，每瓶200 g(相当于100 g大米原料)，121 ℃，高压灭菌20 min。

无乳链球菌的培养基为TSB培养基：胰蛋白胨17 g，大豆蛋白胨3 g，NaCl 5 g，葡萄糖2.5 g，KH2PO42.5 g，H2O 1 000 mL。

1.2 长枝木霉ST-27的发酵及其二氯甲烷萃取物的制备

本实验方法参考文献[19]并做了适当的修改：将长枝木霉ST-27接种于PDA平板上28 ℃恒温培养2～3天后，作为固态培养种子用打孔器打成每个Φ6 mm的小圆饼加入含50 mL PDB培养基的250 mL锥形瓶中，28 ℃、180 rpm的摇床里培养2天，用作液体培养种子。每个含200 mL FS1培养基的1 L锥形瓶中接入10 mL种子液，在28 ℃条件下培养30～42天。固态发酵结束后使用甲醇萃取，甲醇萃取液在45 ℃水浴条件下旋蒸浓缩，浓缩液经二氯甲烷超声萃取，得溶剂萃取物。

1.3 长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌的抑制效果

本实验方法参考文献[20]并做了适当的修改：取“1.2”中制备所得长枝木霉ST-27发酵液的二氯甲烷萃取物用甲醇溶解成50 mg/mL母液备用，使用甲醇对配置好的母液进行二倍法稀释得到25、12.5…0.195 3 mg/mL稀释液备用。将无乳链球菌接种于TSB液态培养基中培养10 h，使用培养基细菌浓度调节为3.42×108CFU/mL，后用TSB培养基稀释1 000倍备用。试验组中在96孔板的每孔分别加入180 μL稀释菌液，20 μL不同浓度的ST-27二氯甲烷萃取物或甲醇溶液，即二氯甲烷萃取物终浓度为5、2.5、1.25 …0.019 53、0 mg/mL；设置阳性对照组，每孔加入180 μL稀释菌液和20 μL甲醇；设置阴性对照组，每孔加入200 μL灭菌TSB液态培养基；设置正常生长对照组，每孔加入180 μL稀释菌液和20 μL灭菌TSB液态培养基；各组设三组平行试验，测定起始OD600值，于37 ℃恒温培养箱静置培养20 h后测定培养后OD600。抑菌率计算方式如下：

1.4 长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌生物被膜的影响

取“1.2”中制备所得长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物用甲醇溶解成200 mg/mL母液备用，使用甲醇对配置好的母液进行二倍法稀释得到100、50…0.195 3 mg/mL稀释液备用。将无乳链球菌接种于TSB液态培养基中培养10 h，使用培养基细菌浓度调节为3.42×108CFU/mL，后用TSB培养基稀释1 000倍备用。试验组中向96孔板的每孔中加入180 μL稀释菌液，20 μL不同浓度的ST-27二氯甲烷萃取物或甲醇溶液，即二氯甲烷萃取物终浓度为5、2.5…0.019 53 mg/mL，于30 ℃恒温培养72 h。取出96孔板，小心倒掉菌液(以免造成生物被膜脱落)，无菌水清洗两遍，倒置晾干，每孔加50 μL的1%的结晶紫染色15 min。无菌水清洗，倒置晾干。每孔加200 μL 95%乙醇溶液溶解结晶紫，酶标仪测定OD620值。

1.5 长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌细胞形态的影响

取OD600值为1的无乳链球菌，稀释1 000倍后加入长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物至最终菌液中样品浓度为2 MIC，设空白对照组，于37 ℃、180 rpm摇床中培养10 h后经3 000 rpm离心1 min，得到的菌液再经生理盐水淸洗两遍，离心收集菌体，用3%戊二醛固定2 h后涂片，磷酸盐缓冲液洗涤3次，依次以30%、50%、75%、95%乙醇顺序脱水各1次，每次10 min，然后以无水乙醇重复脱水3次，每次5 min，使用50%、70%、90%、100%乙酸异戊酯逐级置换乙醇，每级置换2 min，将样品放入Hep-2临界干燥器内，加液态二氧化碳作介质进行干燥，干燥后的标本放入高真空蒸发器中，喷金镀膜，经扫描电子显微镜下观察，拍照。

1.6 常见抗菌药物对无乳链球菌的抑菌效果比较

用临床上常用的抗生素青霉素(penicillin，PC)、四环素(tetracycline，TC)、链霉素(streptomycin，SM)、利福平(rifampicin，RFP)、红霉素(erythromycin，EM)、氨苄青霉素(ampicillin，AMP)、卡那霉素(kanamycin，KAN)、庆大霉素(gentamicin，GEN)，采用药敏纸片法测定无乳链球菌标准菌株对各抗生素的敏感度，与长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物进行活性比较。配制TSB培养基，高温高压灭菌20 min，待TSB培养基温度降至55 ℃左右后以1%比例加入活化好浓度为3.42×108CFU/mL的无乳链球菌。混匀后均匀倒板，每个平板12 mL。待培养皿冷却后，每个培养皿放置一种抗生素，每种抗生素做三个重复。

2 实验结果

2.1 长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌的抑制效果

如表1所示，长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对两株无乳链球菌表现出良好的抑制效果，抑菌圈均接近30 mm，因此本次研究的后期实验采用无乳链球菌标准株ATCC12386。

表1 长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对不同株无乳链球菌的抑制效果Table 1 Inhibition effect of T.longibrachiatum ST-27 dichloromethane extract on S.agalactiae

由表2可知菌液加培养基和菌液加甲醇无差异，甲醇对无乳链球菌无抑制效果。抑菌率为100%的长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物最小浓度为0.312 mg/mL，由此可知，该萃取物对无乳链球菌的最低抑菌浓度(MIC)为0.312 mg/mL。由图1并结合SPSS 20.0 logit回归模型可知，长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌的半数有效量(IC50)为0.035 mg/mL。

表2 长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌的抑制作用Table 2 Inhibition of the dichloromethane extract of ST-27 on S.agalactiae

图1 长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌的抑制效果图Fig.1 Inhibition effect of ST-27 CH2Cl2 extract against S.agalactiae

2.2 长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌生长的影响

由图2可知，空白对照组与加入1/4 MIC、1/16 MIC长枝木霉ST-27发酵液的二氯甲烷萃取物处理后的无乳链球菌生长曲线存在明显差异性。空白对照组与1/4 MIC组均在4 h时达到稳定期，但1/4 MIC处理后的无乳链球菌的稳定期OD600值较空白组低，对数期OD600值增长较空白组平稳。而1/16 MIC组在11 h后达到稳定，对数期延长，稳定期其OD600值与空白组差异不明显。因此可看出在1/4 MIC浓度下活性产物对无乳链球菌可有杀菌作用，在1/16 MIC浓度下活性产物对无乳链球菌存在明显抑制其生长速度的作用。

图2 长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌生长曲线的影响Fig.2 Effects of ST-27 CH2Cl2 extract on growth curve of S.agalactiae

2.3 长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌生物被膜的抑制效果

由图3可知，OD620随长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物的浓度上升而升高，当浓度为lg(c)=3.4即1.25 mg/mL时最高，随后急剧下降，由此可知长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌生物被膜形成具有重要的影响。

图3 长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌生物被膜的影响Fig.3 Effects of ST-27 CH2Cl2 extract on the biofilm of S.agalactiae

2.4 长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌生物形态的影响

由图4可知，未经长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物处理的无乳链球菌呈表面光滑的球形菌，经样品处理后的无乳链球菌在细胞形态上发生了明显变化，主要表现为：表面皱缩、粗糙，个别无乳链球菌出现破裂现象(见图4b箭头所示)。Shan等[21]通过高倍数扫描电镜观察由万古霉素和抗菌肽处理过的无乳链球菌的表面形态，结果显示细胞皱缩和破裂。由此可见活性产物对无乳链球菌的细胞形态有一定的作用，可抑制无乳链球菌的生物被膜形成。

图4 无乳链球菌的扫描电镜图Fig.4 The scanning electron microscopy pictures of S.agalactiae 注：a和b分别为经长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物处理前后的无乳链球菌。Note:a and b are the S.agalactiae before and after treatment with ST-27 CH2Cl2 extract.

2.5 长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物与临床常用抗生素的抑菌活性对比

二氯甲烷萃取物与临床常用抗生素的抑菌活性的实验中所用抗生素药敏纸片规格均为30 μg/片，实验结果由图5可知，无乳链球菌对四环素最敏感，抑菌圈直径为36.67 mm；利福平次之，抑菌圈直径为34.23 mm；链霉素对无乳链球菌无抑制作用。图5中数据可看出长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌的抑制活性可达到临床上无乳链球菌敏感的药物的80%，表现出较强的抑制活性。另一方面，Hu[22]采集了1 000例孕晚期妇女的泌尿生殖道标本进行了无乳链球菌培养及药敏试验研究，结果显示孕晚期妇女无乳链球菌感染率较高，容易通过母婴垂直传播感染新生儿；在实验室药敏结果显示无乳链球菌耐药性较高的三种抗生素依次为四环素(86.44%)、红霉素(73.73%)、阿奇霉素(56.78%)，应早期选择合适抗生素治疗。Zhang等[23]从353例的门诊及住院患者细菌培养分离的无乳链球菌进行耐药性分析，结果显示耐药率最高的四环素(91.5%)、对红霉素、克林霉素、环丙沙星、左旋氧氟沙星耐药率较高，分别为72.0%～77.1%、61.9%～66.7%、23.7%～28.0%、22.9%～25.6%。

图5 无乳链球菌对长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物与临床常用抗生素的敏感性对比Fig.5 Comparison of sensitivity of S.agalactiae to ST-27 CH2Cl2 extract and common clinical antibiotics

综上分析，近年来无乳链球菌对常用抗生素的耐药性不断提高，因此，长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物与临床上常用抗生素相比对无乳链球菌不但具有较强抑菌活性而且不易产生耐药性，是开发出新的抑菌活性物质可以有效缓解无乳链球菌的耐药率升高的这一现状。但考虑到活性物质的浓度更高，且成分复杂，本次实验结果仅能说明长枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物对无乳链球菌的抑制作用与临床上常见的抗生素具有一定的优势，具备继续开发研究的潜力。

3 讨论

本文初步研究了长枝木霉ST-27发酵产物二氯甲烷萃取物对无乳链球菌的抑菌效果。经抑菌实验检测出其对三株不同的无乳链球菌都表现出了良好的抑制作用，对无乳链球菌标准株ATCC12386的MIC值为0.312 mg/mL，表现出良好的抑制活性，与临床上常用抗生素相比也具有一定的优势。对无乳链球菌的生长曲线影响结果显示其在低浓度下对无乳链球菌有抑制作用，高浓度下有杀菌作用，结合扫描电镜结果可发现经过处理后的无乳链球菌的细胞形态有明显变化，个别无乳链球菌出现破裂现象，可证明该活性物质对无乳链球菌的抑制作用之一是作用其生物被膜，为了进一步验证需要进一步采用透射电镜观察其超微结构。无乳链球菌在大自然中不仅以浮游的状态存在，更多情况下也以生物被膜的形式存在，而以生物被膜方式存在的细菌更适应外界环境，有极高的耐药性，并能够逃逸宿主的免疫机制[24]。本研究发现，长枝木霉ST-27发酵产物二氯甲烷萃取物对无乳链球菌生物被膜的形成具有重要的影响，基于此本研究对无乳链球菌的防治提供了新的思路。与此同时，长枝木霉ST-27发酵产物的二氯甲烷萃取物的成分尚未明确，根据相关文献报道[25]，木霉中分离得到具有抑菌效果的代谢产物主要分为两大类：小分子类物质，主要有芳香族化合物、聚酮类、丁烯酸内脂类等；大分子类物质如木霉素、胶霉素、抗菌肽等，在未来研究中，我们将对该萃取产物的成分进一步分析，以期得到主要活性物并分析其结构。