内生真菌Chaetomium globosum S108次生代谢产物分离及黑色素瘤抑制活性研究

张文慧，肖依文,2，梁伟中，汪 涯，高波良，朱 笃,2*

1江西科技师范大学生命科学学院 江西省生物加工过程重点实验室，南昌 330013；2江西师范大学 江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室，南昌 330022

植物内生菌(edophytes)是指一类生活在健康植物组织体内但不引起植物感染病害的微生物，其不仅能促进植物的耐盐、耐旱、耐寒、抗虫等抗逆性，而且蕴含丰富的次生代谢产物合成基因簇，已成为结构多样性天然产物筛选的重要来源[1,2]。东乡野生稻(OryzarufipogonGriff.)是仅残存于江西省东乡县、世界分布最北的野生稻，由于其长期处于野生状态，经历了自然选择，具有良好的抗逆性、抗病虫害、耐寒、耐旱、高产等优良性状[3,4]。本课题组前期对东乡野生稻内生真菌多样性进行了系统的研究，发现其不仅蕴含丰富的植物内生真菌，而且PKS基因检测和植物病原抑制活性筛选结果显示其中含有较丰富的活性次级代谢产物，十分有必要进一步开展研究[5]。

本研究以前期从东乡野生稻中分离得到的一株内生球毛壳菌S108(ChaetomiumglobosumS108)为对象，对其进行发酵培养，初步发现其发酵液对肿瘤细胞具有一定的抑制活性。据文献报道，球毛壳菌素(chaetoglobosin)是球毛壳菌抑制肿瘤细胞的主要物质[6]。为了进一步探究S108发酵液中具肿瘤抑制活性的化合物，我们对其次生代谢产物进行了分离纯化，对分离所得的化合物进行结构鉴定，并进行黑色素瘤抑制活性试验，以期发现具有潜在活性的化合物，这对于丰富球毛壳菌次生代谢产物及其功能多样性具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

1.1.1 菌株材料

内生菌S108分离样品采集自江西省东乡县岗上积镇(N28°14′，E116°36′)野外健康的东乡野生稻的茎部，现保存于江西省生物加工过程重点实验室。ITS-rRNA序列比对结果显示，该菌株与球毛壳菌C.globosum序列同源性高达99%(accession number：KF558876)，因而将其归属为C.globosum。

1.1.2 培养基

土豆葡萄糖琼脂(PDA)培养基(g/L)：200 g土豆、葡萄糖20 g、琼脂20 g，121 ℃灭菌25 min。土豆葡萄糖肉汤(PDB)培养基(g/L)：200 g土豆，葡萄糖20 g，121 ℃灭菌25 min。大米培养基：大米80 g，蒸馏水120 mL，121 ℃灭菌25 min。

1.1.3 主要仪器与试剂

Bruker AV-400和AV-600核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)；AB5600+QTOF高分辨液质联用仪(美国SCIEX公司)；PURIFLASH450中压层析系统(法国Interchim公司)；Waters 1525 型超高效液相(美国Waters公司)；Waters 2489 型半制备液相(美国Waters公司)；Spectramax M2酶标仪(美国分子仪器公司)；分析型色谱柱ODS-C18(250 mm×4.6 mm，日本YMC公司)；制备型色谱柱ODS-C18(250 mm×10 mm，日本YMC公司)；正相色谱硅胶(青岛海洋化工厂)；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(美国Amersham公司)；色谱级纯甲醇、乙腈(德国Merck公司)；分析纯甲醇、乙酸乙酯、乙腈、石油醚、二氯甲烷、无水乙醇、75%乙醇(天津市永大化学试剂开发中心)；色谱纯甲醇、乙腈(德国Merck公司)；小鼠黑色素瘤细胞B16(武汉普诺赛生命科技有限公司)；威罗菲尼(vemurafenib，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 真菌活化及培养

将菌株S108接种至PDA培养基中培养4天使其活化(28 ℃)，待菌落长满平板后，挑取一小块培养基接入到含有100 mL种子培养基(PDB)的250 mL三角瓶中培养5天后得到种子培养液(28 ℃，160 rpm)，把种子培养液接种到40瓶大米发酵培养基中，每瓶接种量为5 mL，静置培养40天(28 ℃)。

1.3 提取与分离

菌株S108培养40天后，收集发酵产物加入80%乙醇超声波辅助提取4次，收集提取液将其减压浓缩至3 L便于下一步的提取，再用乙酸乙酯萃取4次后收集萃取液减压浓缩获得5.2 g乙酸乙酯相提取液浸膏。浸膏使用200～300正相硅胶进行分离，流动相为石油醚∶乙酸乙酯(5∶1→1∶1)，TLC指示合并得到组分A～E。B组分(石油醚∶乙酸乙酯=4∶1)用正相硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯=30∶1→2∶1)洗脱得到亚组份B1～B4，其中B2组分用制备液相(乙腈∶水=95∶5)纯化得到化合物1(2 mg，tR=10 min)，B4组分用制备液相(乙腈∶水=8∶2)纯化得到化合物2(1.2 mg，tR=14 min)。组分C(石油醚∶乙酸乙酯=3∶1)经正相硅胶柱洗脱(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1→6∶1)得到亚组分C1～C3，C3组分经制备液相(乙腈∶水=6∶1)纯化分别得到化合物3(1.8 mg，tR=7 min)，化合物4(1.2 mg，tR=18 min)和化合物5(2 mg，tR=22 mim)。组分D(石油醚∶乙酸乙酯=1∶1)经正相硅胶柱洗脱(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1→4∶1)得到亚组分D1～D5，D2组分用制备液相(乙腈∶水=3∶7)纯化得到化合物6(1.8 mg，tR=8 min)，D5组分用制备液相(乙腈∶水=3∶7)纯化得到化合物7(2.2 mg，tR=13 min)。

1.4 黑色素瘤B16细胞活力试验

黑色素瘤细胞抑制活性实验参考文献方法[7]。首先，将对数生长期的小鼠黑色素瘤B16细胞按照密度为4×104/mL的细胞悬液均匀地接种到96孔板中，100 μL/孔，5%CO2、37 ℃孵育24 h使细胞稳定生长。待测化合物1～7用DMSO稀释至1 mg/mL，后用含有10%胎牛血清(FBS)的培养基稀释成不同的浓度(2.5、5、10 μM)后加入96孔板中，各浓度平行试验6次。阳性对照加入威罗菲尼，空白对照组加入培养基，同时再设置一组对照组加入0.2%的DMSO，在培养24 h和48 h后，再分别加入CCK-8试剂(10 μL/孔)，于培养箱中孵育4 h后，用酶标仪于450 nm处测其OD值，根据公式：细胞抑制率=(对照组平均OD值-实验组平均OD值)/(对照组平均OD值-空白组平均OD值)×100%，计算细胞抑制率。

2 结果和分析

2.1 结构鉴定

化合物1白色粉末,溶于甲醇；分子式为C24H38O4；HR-ESI-MS：m/z391.271 8 [M+H]+，m/z413.252 8 [M +Na]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.73(2H，dd，J=7.4，2.4 Hz，H-3，H-6′′)，7.64(2H，m，H-4′′，H-5′′)，4.23(4H，d，J=4.2 Hz，2×OCH2)，1.73～1.68(1H，m，H-2，H-2′)，1.45(2H，dd，J=12.7，6.6 Hz，H-3)，1.42～1.38(2H，m，H-4，H-4′)，1.36(4H，d，J=3.9 Hz，H-5，H-5′，H-7，H-7′)，0.96～0.97(6H，m，H-6，H-6′，H-8，H-8′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：67.7(C-1，C-1′)，38.8(C-2，C-2′)，30.2(C-3，C-3′)，28.8(C-4，C-4′)，22.7(C-5，C-5′)，10.0(C-6，C-6′)，23.6(C-7，C-7′)，13.0(C-8，C-8′)，132.2(C-1′′，C-2′′)，128.5(C-3′′，C-6′′)，131.0(C-4′′，C-5′′)，168.0(C=O)。以上数据与文献[8]报道一致，故鉴定该化合物为dioctyl phthalate(结构见图1)。

图1 化合物1～7的化学结构Fig.1 The chemical structures of compounds 1-7

化合物2淡黄油状,溶于氯仿；分子式为C10H10O4；HR-ESI-MS：m/z195.065 8 [M+H]+，m/z217.046 6 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.25(1H，d，J=2.2 Hz，H-3)，6.21～6.16(1H，m，H-9)，4.65(1H，ddd，J=9.5，6.2，5.4 Hz，H-5)，2.94～2.68(2H，m，H-8)，1.48(3H，d，J=6.3 Hz，H-10)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：170.3(C-1)，164.6(C-3)，164.0(C-5)，141.6(C-2)，106.9(C-4)，101.4(C-6)，100.4(C-7)，75.7(C-9)，34.6(C-8)，20.4(C-10)。以上数据与文献[9]报道一致，故鉴定该化合物为6-hydroxymellein。

化合物3黄色粉末,溶于氯仿；分子式为C23H27O6Cl；HR-ESI-MS：m/z435.156 9 [M+H]+，m/z457.138 7 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.28(1H，s，H-1)，6.55(1H，s，H-4)，2.98(1H，d，J=10.0 Hz，H-8)，6.06(1H，d，J=15.5 Hz，H-9)，6.52(1H，dd，J=15.5，6.5 Hz，H-10)，2.26(1H，m，H-11)，1.43(2H，m，H-12)，0.91(3H，t，J=7.5 Hz，H-13)，1.40(3H，s，7-Me)，1.08(3H，d，J=6.5 Hz，11-Me)，3.08(1H，d，J=10.0 Hz，H-1′)，1.90(1H，dq，J=10.2，6.5 Hz，H-3′)，4.30(1H，dq，J=10.2，6.2 Hz，H-4′)，1.41(3H，d，J=6.2 Hz，H-5′)，1.13(3H，d，J=6.5 Hz，3′-Me)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：145.6(C-1)，157.7(C-3)，105.0(C-4)，140.5(C-4a)，110.1(C-5)，189.2(C-6)，84.0(C-7)，50.5(C-8)，114.3(8a)，120.2(C-9)，146.9(C-10)，38.9(C-11)，29.2(C-12)，11.7(C-13)，23.3(C-7-Me)，19.4(C-11-Me)，58.2(C-1′)，104.2(C-2′)，44.9(C-3′)，76.9(C-4′)，18.6(C-5′)，8.8(C-3′-Me)，170.5(C-1′′)。以上数据与文献[10]报道一致，故鉴定该化合物为chaetomugilin D。

化合物4黄色粉末，溶于丙酮;分子式为C23H27O6Cl。HR-ESI-MS：m/z435.156 1 [M+H]+，m/z457.138 2 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，(CD3)2CO)δ：7.40(1H，s，H-1)，6.55(1H，s，H-4)，2.98(1H，d，J=10.1 Hz，H-8)，6.03(1H，d，J=15.8 Hz，H-9)，6.48(1H，dd，J=15.8，8.2 Hz，H-10)，2.26(1H，m，H-11)，1.42(2H，m，H-12)，0.90(3H，t，J=7.4 Hz，H-13)，1.49(3H，s，7-Me)，1.08(3H，d，J=6.7 Hz，11-Me)，3.03(1H，d，J=10.1 Hz，H-1′)，1.90(1H，dq，J=10.0，6.9 Hz，H-3′)，4.21(1H，dq，J=10.0，6.4 Hz，H-4′)，1.38(3H，d，J=6.4 Hz，H-5′)，1.07(3H，d，J=6.9 Hz，3′-Me)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：145.6(C-1)，157.7(C-3)，105.0(C-4)，140.4(C-4a)，110.1(C-5)，189.2(C-6)，84.0(C-7)，50.6(C-8)，114.3(8a)，120.2(C-9)，146.9(C-10)，38.9(C-11)，29.2(C-12)，11.7(C-13)，23.2(C-7-Me)，19.4(C-11-Me)，170.6(C-1′)，58.3(C-2′)，104.2(C-3′)，44.9(C-4′)，76.9(C-5′)，18.7(C-6′)，8.8(4′-Me)。以上数据与文献[11]报道一致，故鉴定该化合物为chaetomugilin S。

化合物5黄色粉末，溶于丙酮;分子式为C23H25O6Cl。HR-ESI-MS：m/z433.140 1 [M+H]+，m/z455.122 3 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，(CD3)2CO)δ：7.27(1H，s，H-1)，6.55(1H，s，H-4)，2.98(1H，d，J=10.1 Hz，H-8)，6.06(1H，d，J=15.8 Hz，H-9)，6.52(1H，dd，J=15.8，8.2 Hz，H-10)，2.26(1H，m，H-11)，1.42(2H，m，H-12)，0.90(3H，t，J=7.4 Hz，H-13)，1.41(3H，s，7-Me)，1.08(3H，d，J=6.7 Hz，11-Me)，3.03(1H，d，J=10.1 Hz，H-1′)，1.90(1H，dq，J=10.0，6.9 Hz，H-3′)，4.30(1H，dq，J=10.0，6.4 Hz，H-4′)，1.41(3H，d，J=6.4 Hz，H-5′)，1.13(3H，d，J=6.9 Hz，3′-Me)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：201.2(C-3′)，183.4(C-6)，167.9(C-1′)，162.7(C-8)，157.1(C-3)，151.5(C-1)，148.0(C-10)，139.7(C-4a)，125.1(C-2′)，119.8(C-9)，110.4(C-8a)，108.9(C-5)，105.4(C-4)，87.6(C-7)，70.9(C-5′)，51.0(C-4′)，39.0(C-11)，29.1(C-12)，26.2(CH3-C7)，21.4(CH3-C4′)，19.3(CH3-C11)，13.5(C-6′)，11.7(C-13)。以上数据与文献[12]报道一致，故鉴定该化合物为chaetoviridin A。

化合物6黄色粉末，溶于丙酮;分子式为C32H36O5N2。HR-ESI-MS：m/z551.251 3 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，(CD3)2CO)δ：6.27(1H，s，NH-2)，3.87(1H，m，H-3)，3.13(1H，dd，J=8.6，3.7 Hz，H-4)，1.89(1H，m，H-5)，2.83(1H，d，J=3.9 Hz，H-7)，2.23(1H，m，H-8)，2.86(1H，dd，J=8.0，4.2 Hz，Ha-10)，2.54(1H，dd，J=15.0，7.9 Hz，Hb-10)，1.15(3H，d，J=6.5 Hz，H-11)，1.27(3H，s，H-12)，6.17(1H，dd，J=10.0，15.0 Hz，H-13)，5.11(1H，m，H-14)，2.20(1H，m，Ha-15)，1.80(1H，m，Hb-15)，2.41(1H，m，H-16)，5.49(1H，d，J=9.1 Hz，H-17)，5.09(1H，s，H-19)，6.57(1H，d，J=16.7 Hz，H-21)，7.62(1H，d，J=16.7 Hz，H-22)，1.10(3H，d，J=5.6 Hz，Me-16)，1.39(3H，s，Me-18)，3.71(1H，d，J=2.7 Hz，OH-19)，8.13(1H，s，NH-1′)，6.85(1H，s，H-2′)，7.39(1H，d，J=7.2 Hz，H-4′)，7.14(1H，t，J=7.5 Hz，H-5′)，7.19(1H，t，J=7.5 Hz，H-6′)，7.29(1H，d，J=7.4 Hz，H-7′)；13C NMR(150 MHz，(CD3)2CO)δ：201.0(C-20)，197.8(C-23)，172.8(C-1)，138.9(C-17)，136.7(C-1′a)，135.7(C-21)，132.7(C-22)，132.6(C-14)，132.2(C-18)，128.9(C-13)，127.8(C-3′a)，124.2(C-5′)，121.2(C-2′)，118.9(C-6′)，118.5(C-4′)，111.4(C-7′)，109.7(C-3′)，63.2(C-9)，62.0(C-7)，57.2(C-6)，52.2(C-3)，48.3(C-8)，46.7(C-4)，41.3(C-15)，36.4(C-5)，33.2(C-10)，32.0(C-16)，20.4(CH3-C16)，12.3(CH3-11)，9.8(CH3-C18)。以上数据与文献[13]报道一致，故鉴定该化合物为chaetoglobosin A。

化合物7淡黄色粉末，溶于丙酮;分子式为C15H18O6。HR-ESI-MS：m/z293.090 4 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：12.20(1H，s)，6.59(1H，d，J=2.3 Hz，H-4′)，6.43(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，4.93(1H，d，J=2.9 Hz，H-4)，4.02(1H，dd，J=11.6，8.3 Hz，H-5)，3.86(3H，s，H-8)，3.79(1H，dd，J=11.6，8.6 Hz，H-5)，3.08～3.02(1H，m，H-2)，3.00(1H，d，J=3.1 Hz，H-3)，2.08(1H，d，J=11.8 Hz，H-7)，1.97(1H，dd，J=11.9，4.2 Hz，H-7)，1.56(3H，s，H-9)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：202.9(C-1)，166.6(C-1′)，165.2(C-3′)，140.3(C-6′)，110.0(C-2′)，108.6(C-4′)，106.4(C-5′)，101.7(C-6)，76.9(C-4)，62.9(C-5)，55.8(C-8)，44.9(C-3)，39.9(C-2)，39.1(C-7)，23.8(C-9)。以上数据与文献[14]报道一致，故鉴定该化合物为6-O-demethyl-5-deoxyfusarubin。

2.2 黑色素瘤B16细胞活力试验

将分离纯化后获得的7个单体化合物进行黑色素瘤B16细胞活力影响试验，结果显示，当各化合物浓度均为5 μmol/L时，仅有化合物2对黑色素瘤B16细胞有一定的抑制活性，其余化合物未见明显抑制肿瘤细胞增殖作用。如表1所示，当化合物2的浓度为2.5 μmol/L时，与对照组相比黑色素瘤B16细胞存活率有明显下降，且随浓度的增加，对B16细胞杀伤能力随之增强，在药物浓度达到10 μmol/L时，细胞死亡最多，其IC50值为2.24 μmol/L，与阳性对照威罗菲尼(vemurafenib)相比，化合物2显示出良好的抑制效果；在作用48 h后，仍有良好的抑制作用，且随浓度的增大B16细胞存活率有明显的降低，其IC50值为2.28 μmol/L。

表1 化合物2对黑色素瘤B16细胞的抑制率(n=6)Table 1 Inhibition rate of compound 2 on melanoma B16 cells (n=6)

3 讨论

C.globosum为毛壳菌科、毛壳菌属真菌，自1973年Sekita从C.globosum中分离到球毛壳菌素A和B以来，已从球毛壳菌属中发现了400多个结构新颖的活性次级代谢产物，这些化合物主要包括球毛壳菌素类、嗜氮酮类、萜类、酯类、黄酮类、异香豆素类等[15]，其中球毛壳菌素类与嗜氮酮类化合物占绝大多数，而异香豆素类等其他化合物则较少被分离，仅Yan等[16]从银杏来源的球毛壳菌中分离到异香豆素类化合物prochaetoviridin A。本研究从S108中分离得到chaetomugilin D(3)、chaetomugilin S(4)、chaetoviridins A(5)等3个嗜氮酮类化合物以及该菌中常见的生物碱类化合物球毛壳素A(6)，同时从中分离到异香豆素类化合物6-hydroxymellein(2)及萘醌类化合物6-O-demethyl-5-deoxyfusarubin(7)，化合物2和7均为首次从毛壳菌属真菌中分离得到。6-Hydroxymellein(2)是一种常见的生物合成中间体，微生物以其为前体可以合成众多的结构类似物[17]，这表明S108基因组中可能含有相关的聚酮合成酶(PKS)基因簇，开展S108的次级代谢产物的进一步挖掘，有望从中分离出新结构、新活性的化合物。

本研究从球毛壳菌C.globosumS108中分离纯化得到的7个化合物，其生物活性已有较多报道，chaetomugilin D(3)、chaetomugilin S(4)、chaetoviridins A(5)等嗜氮酮类化合物，其中化合物3、4可有效抑制幼苗的生长，如Wang等[18]从一株银杏来源的球毛壳菌中分离得到的化合物3、4对幼苗生长有明显的抑制作用，与广谱除草剂草甘膦相比其IC50更低，因此有待被开发为天然环保型除草剂。化合物5显示出良好的抗真菌活性，对核盘病菌有良好抑制作用，其防治效果与广谱杀菌剂多菌灵效果相当[16]。球毛壳素A(6)亦显示了较好的抗癌活性，如Knudsen等[19]研究发现从青霉菌中分离到的化合物6可作为治疗慢性淋巴白血病(CLL)的潜在药物，在模拟淋巴组织的培养条件下，也表现出显著的诱导CLL细胞凋亡作用。目前，有关6-O-demethyl-5-deoxyfusarubin(7)活性未有报道，但其类似物镰红菌素具有抑制血液肿瘤细胞系的增殖并增加细胞凋亡的作用[20]。本研究以黑色素瘤B16细胞为对象，开展化合物抑制肿瘤细胞的评价，结果表明，除化合物2外，其他6种化合物均对黑色素瘤B16细胞没有抑制作用。

迄今，6-hydroxymellein(2)仅从红树的内生真菌褐瘤菌(Daldiniaeschscholtzii)和土曲霉(Aspergillusterreus)中分离得到，发现其对拟南芥花粉发育有抑制作用[9,21]。此外，Yang等[22]发现化合物2对于人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人胰腺癌细胞PANC-1无抑制作用，对非小细胞肺癌细胞A549和人肝癌细胞BEL-7402仅有微弱的抑制活性，其IC50分别为170.6 mg/L和315.0 mg/L。本研究首次发现6-hydroxymellein(2)对黑色素瘤B16细胞有良好的抑制活性，IC50为2.24 μmol/L。黑色素瘤作为临床上常见的皮肤恶性肿瘤，病恶性程度高、易转移，发病率有逐年增加趋势[23]，因此6-hydroxymellein(2)新活性的发现有助于黑色素瘤治疗药物的研发，同时为治疗黑色素瘤药物开发提供了新思路。