UPLC-Q-TOF-MS/MS结合网络药理学和分子对接探讨椭圆叶花锚抗肝炎的药效物质及作用机制

左文明，李锦萍，李彩明，王虹雨，刘力宽*，曾 阳,2*

1青海师范大学生命科学学院 青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海 西宁810008；2高原科学与可持续发展研究院，西宁 810008

椭圆叶花锚(HaleniaellipticaD.Don)为龙胆科(Gentianaceae)花锚属(Halenia)植物，性味苦寒，全草入药，藏医药系统常用于治疗肝胆系统疾病[1]。临床用于治疗肝炎等“协日”和“热”过剩所致疾病。椭圆叶花锚虽然在临床已得到使用，并且椭圆叶花锚对治疗肝炎、实验性肝损伤确有疗效已被证实[2]。但关于其抗肝炎的文献报道却不多，作用机制更尚不清楚，因此需要进一步研究，明确其作用机制，为藏药的发展及利用提供理论依据。

网络药理学是一门新兴的药理学分支学科，以系统生物学和网络生物学基本理论为基础，通过利用相关数据库和算法进行深度挖掘、分析和整理汇总，从而构建药物作用于疾病的靶点及机制网络，具有整体性、系统性的特点，因此，特别适合于中藏药这种组分多、作用靶点多及作用途径复杂的药物作用机制研究[3-5]。本研究拟利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术，通过网络药理学的研究方法，探究椭圆叶花锚抗肝炎的潜在作用机制，并筛选出其活性成分及其作用靶点，以期为椭圆叶花锚抗肝炎药理作用机制的进一步研究提供新的思路和理论基础。

1 仪器与材料

Xevo G2-XS QTof液质联用仪(美国Waters公司)；ACQUITY UPLC HSS T3(100×2.1 mm,1.8 μm)色谱柱(美国Waters公司)；Secura513-1CN精密天平(德国赛利多斯)；KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山舒美超声仪器有限公司)；N1200BV-W小型浓缩系统(日本东京理化器械株式会社)；Eyela CA-1115B冷却水循环装置(日本东京理化器械株式会社)；Eyela FDU-2110冷冻干燥机(日本东京理化器械株式会社)；Milli-Q超纯水仪(美国密理博)，5810R台式高速冷冻离心机(德国艾本德)。

甲醇、乙腈、甲酸为质谱级(美国Fisher公司)；氢氧化钠(ACS级)(美国Sigma公司)；亮氨酸脑啡肽(StandardsKit for TOF G2-S)(美国Waters公司)；蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)；超纯水(Milli-Q超纯水仪制备)；其它试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 椭圆叶花锚化学成分分析

椭圆叶花锚样品采集于青海地区，由青海师范大学曾阳教授鉴定为椭圆叶花锚(HaleniaellipticaD.Don)。取样品20 g，粉碎，过80目筛，得样品粉末。精密称取粉末0.5 g，置50 mL锥形瓶，加入7.5 mL甲醇浸没，50 ℃水浴，超声提取1 h，取粗提液100 μL于1.5 mL离心管内，加入75%乙腈500 μL稀释，混匀静置2 min，冷冻离心15 min(12 000 rpm，10 ℃)。取上清液过0.2 μm微孔滤膜至进样瓶，4 ℃保存，备用。

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，体积流量0.3 mL/min,进样量1 μL，柱温40 ℃；流动相0.1%甲酸水溶液(A)-0.01%甲酸乙腈溶液(B)；梯度洗脱条件：0～1 min，99%→90%A；1～10 min，90%→74%A；10～14 min，74%→34%A；14～16 min，34%→1%A；16～19 min，1%A；19～20 min，1%→99%A；20～23 min，99%A。

质谱条件：电喷雾离子源正/负离子模式(ESI+/ESI-)，Continuum模式采集MSE数据：校正液为200 pg/μL亮氨酸脑啡肽(leucine-enkephalin)，0.5 mM甲酸钠(sodium-formate)。扫描范围m/z50～1 200，扫描时间0.2 s，检测时间20 min。低能量碰撞电压(CE)6 V，高能量碰撞电压为20～60 V；正/负离子模式毛细管电压均为2 kV，锥孔电压为45 V，离子源温度为100 °C，辅助喷雾电离与去溶剂气体为高纯度N2，去溶剂化温度350 °C，锥孔气体流量50 L/h，去溶剂化气体流量600 L/h。

利用UNIFI数据处理系统、Masslynx V4.1软件及文献比对，完成色谱峰对应化合物的定性分析，筛选确定椭圆叶花锚的化学成分。

2.2 椭圆叶花锚作用靶点预测

通过Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)对鉴定的化合物检索查询Canonical SMILES号，未检索到的化合物利用ChemDraw将化合物结构式保存为SDF格式，将SDF格式文件导入OpenBabel获得Canonical SMILES号；将获得的Canonical SMILES号上传Swiss Target Prediction数据库(http://swisstargetprediction.ch/)，点击Predict targets进行预测分析，输出化合物靶点信息[6]。将获得的化合物靶点信息导入Uniport数据库(https://www.uniprot.org/)，物种选择“Homo Sapiens”，进行标准化，下载结果。以关键词“hepatitis”在DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中检索疾病相关靶点。将椭圆叶花锚活性成分的靶点信息与肝炎疾病相关的靶点信息构建韦恩图，得到椭圆叶花锚治疗肝炎疾病的潜在靶点。

2.3 构建蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)

将“2.2”获取的潜在靶点导入String数据库(https://string-db.org/)，选择“Multiple protein”，物种选择“Homo Sapiens”，下载蛋白相互作用结果，导入Cytoscape 3.6.0软件，得到蛋白相互作用网络图。

2.4 GO功能与模块分析、KEGG 富集通路分析

将筛选出的椭圆叶花锚治疗肝炎的潜在靶点输入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行基因本体(Gene Ontology，GO)生物学过程分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，以P<0.05为筛选条件，得到相关分析结果。

2.5 椭圆叶花锚化学成分-靶点-通路网络构建

利用Cytoscape 3.6.0软件构建椭圆叶花锚化学成分-靶点-通路网络图。其中，节点代表化学成分、靶点和信号通路，边用来连接化学成分、靶点和信号通路。

2.6 主要活性成分-靶点分子对接验证

对筛选的椭圆叶花锚主要活性成分及核心靶点进行分子对接验证，并用治疗乙型肝炎药物Entecavir做对照分析。首先通过Chem 3D 19.0对主要活性成分化学结构进行优化，然后用AutoDock 4.2.6确定配体可旋转键等，之后从PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb)获得关键靶点的3D结构，运用PyMOL 2.3.4软件对蛋白质进行去水、去配体等操作，使用 AutoDock 4.2.6软件对关键靶点进行加氢和计算电荷等处理，最后利用AutoDock Vina 1.1.2软件进行对接，并用PyMOL 2.3.4软件对结果进行可视化处理。

3 结果

3.1 椭圆叶花锚主要化学成分

通过UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析得到椭圆叶花锚总离子流图(见图1)。利用UNIFI数据处理系统、Masslynx V4.1软件及文献比对，完成色谱峰对应化合物的定性分析，得到40个化合物，主要包括獐牙菜苷、车叶草苷酸、马钱苷酸、β-天麻素、京尼平苷酸及口山酮类等(见表1)。

图1 椭圆叶花锚样品TIC图Fig.1 TIC diagram of positive and negative ion patterns of Halenia elliptica D.Don

表1 椭圆叶花锚中主要化学成分Table 1 Identification of chemical constituents in Halenia elliptica D.Don

续表1(Continued Tab.1)

3.2 活性成分靶点预测

按照方法“2.2”，利用Swiss Target Prediction数据库对40个化合物进行靶标预测，其中ascorbylglucoside化合物靶点预测结果中probability>0的结果为0个。将审核过的462个靶点与604个DisGeNET数据库检索与肝炎相关的靶点和9 631个GeneCards数据库检索相关靶点，构建韦恩图(图2)，得到33个椭圆叶花锚治疗肝炎的潜在作用靶点，靶点信息见表2。

表2 椭圆叶花锚抗肝炎潜在靶点Table 2 Potential target of anti-hepatitis in the Halenia elliptica D.Don

图2 椭圆叶花锚抗肝炎靶点韦恩图Fig.2 Venn diagram of anti-hepatitis target of Halenia elliptica D.Don

3.3 蛋白-蛋白相互作用网络构建

按照方法“2.3”，得到蛋白相互作用网络图，如图3所示，节点表示靶点，边表示靶点间关联，靶点大小和颜色与degree值成正相关。该网络共有33个靶点、348条边，平均节点度21.1。其中具有较大度值(degree值>25)的蛋白质有VEGFA、TNF、IL6、MAPK1、CASP3、STAT3、PTGS2、MAPK8、JUN等。通过网络图，能直观看出靶点之间复杂的互作关系，进一步表征了椭圆叶花锚通过多成分、多靶点协同调控治疗肝炎的作用特点。

图3 靶点间相互作用网络Fig.3 Interaction network among targets

3.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

将“2.2”筛选出的椭圆叶花锚治疗肝炎的潜在靶点输入DAVID数据库进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。从生物过程(biologicalprocess，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞组分(cellular component，CC)3个水平对33个靶点进行GO功能富集分析，按照P<0.05的阈值过滤，3个水平分别得到28、16、4条生物功能。按照富集的显著程度取排名靠前的条目绘制可视化条形图，见图4。KEGG通路富集分析，按照P<0.05的阈值过滤，得到53条通路，选取排名靠前的通路绘制气泡图，见图5。

图4 GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

GO 分析显示，在生物学过程方面，主要包括白细胞迁移(leukocyte migration)、一氧化氮生物合成过程的正调控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、血小板活化(platelet activation)、细胞外调节蛋白酶ERK1和ERK2级联的正调控(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade)、平滑肌细胞增殖的正调控(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)、细胞对糖皮质激素的反应(response to glucocorticoid)、FcεRI受体信号通路(Fc-epsilon receptor signaling pathway)、磷脂酰肌醇3-激酶信号转导的调控(regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling)、白细胞与细胞的粘附(leukocyte cell-cell adhesion)、蛋白质磷酸化(protein phosphorylation)、肽丝氨酸磷酸化(peptidyl-serine phosphorylation)、细胞形状的调节(regulation of cell shape)、肽基苏氨酸磷酸化(peptidyl-threonine phosphorylation)、磷脂酰肌醇-3-磷酸酯的生物合成过程、(phosphatidylinositol-3-phosphate biosynthetic process)等生物过程。细胞组分方面，靶点涉及膜(membrane)、质膜的外侧(external side of plasma membrane)、膜筏(membrane raft)、细胞表面(cell surface)、质膜的组成部分(integral component of plasma membrane)等组分。分子生物学功能方面涉及DNA结合(DNA binding)、转录因子结合(transcription factor binding)、转录因子活性，序列特异性DNA结合(transcription factor activity,sequence-specific DNA binding)、ATP结合(ATP binding)、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、激酶活性(kinase activity)、转录调控区DNA结合(transcription regulatory region DNA binding)、染色质结合(chromatin binding)、RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性DNA结合(RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific DNA binding)、转录激活子活性，RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性结合(transcriptional activator activity,RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific binding)等分子生物功能。

KEGG 通路富集结果(图5)显示椭圆叶花锚抗肝炎的靶点主要涉及TNF信号通路(14个靶点，42%)、乙型肝炎(11个靶点，33%)、Toll样受体信号通路(9个靶点，27%)、甲型流感(10个靶点，30%)、T细胞受体信号通路(8个靶点，24%)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)(9个靶点，27%)、胰岛素抵抗(8个靶点，24%)、神经营养蛋白信号通路(8个靶点，24%)、EB病毒感染(8个靶点，24%)、HTLV-I感染(10个靶点，30%)、破骨细胞分化(8个靶点，24%)、丙型肝炎(8个靶点，24%)、FoxO信号通路(8个靶点，24%)等信号通路。

图5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

3.5 椭圆叶花锚主要成分-靶点-通路网络构建

按照“2.5”项中方法构建椭圆叶花锚主要成分-靶点-通路网络，其中“菱形”表示化学成分，“圆形”表示抗肝炎作用靶点，“V形”表示通路，由图6可知该网络由92个节点，包括种39种成分、33个靶点、20条通路和307条边，其中化学成分J24、J34、J35、J39、J38、J17、J36、J27、J25、J40等节点较大，表明与其相连的节点较多，可能是椭圆叶花锚治疗肝炎疾病的重要活性成分，另外PIK3CA、TNF、PIK3R1、MAPK8、LGALS3、PTGS2、MAPK1、MAPK14、APP、STAT3、IL6等靶点节点较大，可能是椭圆叶花锚治疗肝炎疾病的重要作用靶点，其中TNF、Toll-like receptor、FoxO、HIF-1、VEGF、Fc epsilon RI等通路可能是椭圆叶花锚治疗肝炎疾病的重要通路。

图6 成分-靶点-通路图Fig.6 Compound-target-pathway network

3.6 主要活性成分-靶点分子对接验证

主要活性成分与关键靶点的分子对接结果结合能见表3。一般认为，对接能量值小于-4.25 kcal/mol表示两者间有一定的结合活性，小于-5.0 kcal/mol表示有较好的结合活性，小于-7.0 kcal/mol表示有强烈的结合活性[7]。化合物与靶点对接结果在PyMOL软件中进行可视化处理(见图7)。分子对接结果显示，网络药理学所预测的核心成分与关键靶点均可自发结合，证实了网络药理学预测结果的可靠性。

表3 椭圆叶花锚抗肝炎核心成分与关键靶点的分子对接结果Table 3 Molecular docking results of core anti-hepatitis components of Halenia elliptica D.Don with key targets

图7 关键化合物与靶点的分子对接示意图Fig.7 Molecular docking diagram of key compounds and core targets注：A～H分别为：J24与PIK3CA、J24与TNF、J24与PIK3R1、J24与MAPK8、J24与LGALS3、J35与PIK3CA、J35与PIK3R1、J35与LGALS3。Note:A～H are as follows:J24 and PIK3CA,J24 and TNF,J24 and PIK3R1,J24 and MAPK8,J24 and LGALS3,J35 and PIK3CA,J35 and PIK3R1,J35 and LGALS3.

4 讨论

本研究通过UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析了椭圆叶花锚40种化学成分，主要为以口山酮及其苷为主的黄酮类、裂环烯醚萜、三萜和生物碱类成分。其中J34、J39、J35、J24、J38等度值较大，且度值排名前十化合物中4个为口山酮类成分，表明口山酮类成分可能是椭圆叶花锚抗肝炎的主要活性成分，且Zhang等[8]研究表明花锚及其所含的口山酮苷为抗肝炎主要成分，是通过增加蛋白质的合成和肝细胞内的糖元和核糖核酸，促进肝细胞合成来实现保肝作用。Wang等[9]探究了2种口山酮单体对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用及其具体机制，发现2种口山酮化合物均能有效抑制肝癌细胞HepG2的增殖，其机制可能是通过诱导细胞自噬实现。Zhang等[10]研究了山奈酚(kaempfer1)对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤的作用，发现山奈酚通过抑制JNK通路来保护肝细胞启动坏死模式，启动线粒体功能，且山奈酚能上调肝细胞中的GSH，从而达到保肝作用。Shakya等[11]研究发现山奈酚通过抑制过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶等抗氧化酶的表达，从而降低由酒精和多不饱和脂肪酸引起的小鼠肝组织的氧化应激反应，进而对由此引发的肝损伤起到一定的保护作用。其余几种度值较大的重要成分文献报道较少，其药效学及作用机制需进一步实验证明。

由KEGG通路富集及成分-靶点-通路网络图可知，PIK3CA、TNF、PIK3R1、MAPK8、LGALS3、MAPK1、MAPK14、STAT3、IL6、PTGS2等靶点和TNF、Toll-like receptor、FoxO 、HIF-1、VEGF、Fc epsilon RI等信号通路degree值较大，与其相连的成分较多，可能是椭圆叶花锚抗肝炎的主要潜在靶点与通路。

PI3K信号通路是细胞内控制细胞的增殖、凋亡和代谢的关键性信号转导通路[12-14]，且PIK3CA和PIK3R1在肝癌、脑癌、乳腺癌、胃癌和结肠癌里突变率较高[15,16]。Griffith等[17]通过研究人类乳腺癌中PIK3CA和PIK3R1基因表达情况，从而创建了PIK3CA和PIK3R1影响突变的肿瘤基因型谱，为基因治疗癌症开辟了新途径。Xiao等[18]研究发现亚低温预处理能够通过PI3K/AKT/FOXO3a通路抑制炎症细胞因子的释放和凋亡，对缺血再灌注肝损伤具有保护作用。Jiang等[19]研究发现表没食子儿茶素没食子酸酯能显著改善胆道梗阻大鼠肝损伤及病理形态，其作用机制可能是通过调控PI3K/Akt信号通路，促进PI3K、AKT的磷酸化，抑制肝细胞的凋亡来实现的。PIK3CA和PIK3R1均属于PI3K信号通路，PI3K/Akt通路可通过激活肝星状细胞和成纤维细胞促进肝纤维化[20]，椭圆叶花锚中口山酮类成分可能是通过介导PI3K信号通路，抑制肝细胞凋亡来实现抗肝炎的作用。

MAPKs是众多信号蛋白的一种，其激活调控一系列细胞活动。活化的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通过磷酸化核转录因子、细胞骨架蛋白及酶类等参与细胞增殖、分化、转化及凋亡的调节，并与炎症、肿瘤等多种疾病的发生密切相关[21]。Roman等[22]研究发现，在RAW264.7巨噬细胞中，sPGN强度将会激活MAPK1/ERK2通路，中度激活MAPK8/JNK通路，轻度激活P38通路，其中ERK通路主要介导炎症反应，P38通路在炎症条件下的激活具有多种特性[23]。其中MAPK8基因在肝癌，胃癌，胰腺癌等人体的多个部位的肿瘤组织中均呈现高表达，致癌机制均是MAPK8通路先被外界刺激因素激活，转至细胞核内提高转录因子的活性，进一步使癌细胞增殖和分化[24,25]。

TNF作为一种重要的细胞因子，可诱导细胞内多种信号通路，包括增殖、凋亡、炎症、免疫等。Wang等[26]研究发现，慢性丙型肝炎患者TNF水平较正常健康人明显偏高。Tilg等[27]研究发现慢性乙型肝炎患者血清致炎因子TNF-α、IL-6水平的高低能够反映肝细胞损害的程度。TNF-α、IL-6作为重要的致炎因子，对乙肝的发生、发展起到了重要的作用，且与疾病的严重程度呈正相关，因此，目前研究认为中医药可以通过降低血清中TNF-α、IL-6水平而起到保肝作用[27]。

综上，本研究在椭圆叶花锚化学成分的测定分析基础上，利用网络药理学的分析方法，分析了椭圆叶花锚40种化学成分33个抗肝炎的潜在作用靶点，发现椭圆叶花锚可能通过白细胞迁移、一氧化氮生物合成过程的正调控、血小板活化、细胞外调节蛋白酶ERK1和ERK2级联的正调控、磷脂酰肌醇3-激酶信号转导的调控等生物过程，以及TNF、PI3K、Toll-like receptor、FoxO、HIF-1、VEGF、Fc epsilon RI等关键信号通路，发挥抗肝炎的作用。分子对接结果验证了预测的主要化学成分和关键靶点有较好结合活性，表明本研究的预测较为准确可靠，当然，本研究也具有一定局限性，如数据库不完善等，因此后续还需对相关靶点通路进行验证。