深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 抑菌活性及对番茄幼苗促生效果研究

梁 松，王建霞，魏甜甜，张静蕾，胡春艳，姚艳平

（1．山西农业大学 植物保护学院，山西 太谷 030801；2．山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801）

化学防治一直在植物病害防治中扮演重要的角 色，但近年来，长期化学防治带来的问题越来越被人们所重视，例如农药残留和生态环境污染等问题。生物防治作为一种安全环保的防治措施，而成为目前防治植物病害研究工作的热点。木霉菌（spp.）是一种重要的生防真菌，可通过竞争作用、产生抑菌次生代谢产物、重寄生作用、促生作用以及诱导植物抗病性等机理达到防治植物病害的目的，因此木霉菌也被誉为最具开发潜力的生防菌。

木霉菌作为生防真菌已被广泛报道，自从Oros等于1932 年首次发现木霉对土壤中的几种真菌具有拮抗作用后，人们开始逐渐认识到木霉菌可以抑制植物病害并且促进植物生长。20 世纪80 年代，研究人员在木霉研究和应用方面就有过诸多报道，20 世纪90 年代至今，木霉菌在植物病害防治和促生方面的研究更加深入。Kottb 等发现，利用棘孢木霉（）的挥发性代谢产物6-戊基-2H-吡喃-2-酮（6PP）处理拟南芥（），激活了拟南芥的防御反应，减轻了对灰霉菌（）和十字花科链格孢病菌（）的侵染。Kishimoto 等发现，经绿色木霉（）的挥发性代谢产物1-辛烯-3-醇处理拟南芥后，通过激活茉莉酸（JA）依赖的防御途径，增强了拟南芥对病原体的抗性。Malmierca 等发现，经哈茨木霉（）的非挥发性代谢产物Trichodiene 处理番茄后，上调了植物防御相关基因，尤其是水杨酸（SA）相关基因。

番茄（）是我国重要的蔬菜品种之一，其不仅含有多种营养成分而且还具有防癌抗癌的作用，因而成为人们生活中常见的一种蔬菜。在北方，番茄种植主要以保护地栽培为主。由于设施连作次数的增加和不合理的施肥灌溉等农艺措施，引起番茄品质变差、产量下降等问题，成为设施栽培番茄的主要障碍。应用微生物改善植物根际生态环境是目前研究的热点。目前常见的微生物包括木霉菌（spp.）、芽孢杆菌（spp.）和假单胞菌（spp.）等，这些微生物可以通过抑制病原菌生长、促进植物生长和土壤生物修复等途径改善土壤微生态环境。

本研究以深绿木霉（）T1和哈茨木霉（）T21 为研究对象，测定其对7 种植物病原真菌的抑菌活性，同时通过灌根法研究其对温室连作土壤状态下番茄幼苗的促生效果，为进一步深入研究木霉抑菌和促生机理提供理论基础和科学依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试木霉菌株 深绿木霉（）T1、哈茨木霉（）T21，均分离自山西农业大学园艺站温室土壤。

1.1.2 供试植物病原真菌 尖孢镰刀菌番茄专化型（f.sp.）、番茄早疫病菌（）、芒果炭疽病菌（）、苹 果 轮 纹 病 菌（）、禾谷镰刀菌（）、串珠镰刀菌（）、玉米链格孢叶枯病（），均由山西农业大学植物病理实验室提供。

1.1.3 供试培养基 马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）；马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB），以上培养基均经121 ℃高压灭菌后使用。

1.1.4 供试番茄种子 番茄种子品种：‘东圣一号’。

1.1.5 供试土壤 山西农业大学园艺站常年种植番茄的温室连作土壤。

1.2 木霉菌对病原真菌的拮抗作用研究

采用平板对峙培养法测定木霉菌对病原菌的拮抗作用，取活化后直径约为5 mm 的病原菌菌饼，接种于PDA 培养基，在距离病原菌菌饼5 cm 处放置5 mm 木霉菌饼，以不接种木霉菌为对照，每个处理重复3 次。28 ℃恒温培养7 d，7 d 后计算抑菌率。

抑菌率＝（对照病原菌的直径－对峙培养病原菌的直径）/对照病原菌的直径×100%。

1.3 木霉挥发性代谢产物抑菌效果研究

采用平板对扣法测定木霉挥发性代谢产物的抑菌活性，将5 mm 木霉菌饼接到PDA 培养基中，28 ℃培养3 d 后，在PDA 培养基上接种5 mm 病原菌菌饼，将生长3 d 的木霉皿底与接种病原菌菌饼的皿底对扣，中间间隔一层玻璃纸。放入28 ℃培养箱中培养7 d，以不对扣为对照，计算抑菌率。抑菌率的计算方法参考1.2。

1.4 木霉菌非挥发性代谢产物抑菌效果研究

1.4.1 木霉菌无菌发酵液的制备 将木霉菌株接入PDB 培养基，置于28 ℃，180 r·min的恒温摇床中培养7 d。培养结束后，先将培养液通过无菌纱布过滤大部分菌丝，再经过12 000 r·min离心10 min，使杂质沉淀，取上清液，过0.22 μm 无菌滤膜，获得无菌发酵液。将获得的发酵液保存至4 ℃冰箱。

1.4.2 木霉菌非挥发性代谢产物抑制病原菌菌丝生长试验 采用固体稀释法测定，将发酵液与熔融的PDA 培养基（55 ℃）按1∶2 混匀后，均匀倒入平板中，以加入无菌水作为对照，待培养基凝固后，用直径为5 mm 的打孔器取植物病原真菌菌饼置于培养基中间，放入28 ℃培养箱中培养7 d，每个处理重复3 次，采用十字交叉法计算菌落直径，并计算抑菌率。抑菌率的计算方法参考1.2。

1.4.3 木霉菌非挥发性代谢产物抑制病原菌孢子萌发试验 参考凹玻片法并加以改进，制备病原菌孢子悬浮液（1×10个·mL），取无菌1.5 mL 离心管，加入600 μL 病原菌孢子悬浮液和600 μL 木霉菌无菌发酵液，充分混匀，以加无菌水作为对照，取60 μL 混合液置于灭菌凹玻片中，放入铺有一层滤纸的培养皿中，置于28 ℃培养，分别在8 h 后镜检，每个处理重复3 次，观察孢子萌发情况，以孢子芽管的长度超过孢子直径的1/2 记作已萌发的孢子。

孢子萌发率＝孢子萌发数/总孢子数×100%

孢子萌发抑制率＝（对照孢子萌发率－处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率×100%

1.5 木霉菌对番茄幼苗促生效果研究

木霉分生孢子悬浮液的制备：将木霉菌T1、T21 置于PDA 培养基中培养7d，加无菌水制成分生孢子悬浮液，血球计数板计数并调整孢子浓度为1×10个·mL。

先将番茄种子进行育苗，长至四叶一心后进行移栽，将长势一致的番茄幼苗移栽至带土盆钵内，盆钵直径11.7 cm，高9.5 cm，每盆装土500 g，移植四叶一心的番茄幼苗。放置于光照培养箱中，光周期为14 h 白光（光照强度30 000 lx），10 h 黑夜，白天温度28 ℃，晚上温度20 ℃。移栽后3 d，进行木霉孢子悬浮液灌根处理，每2 d 灌根1 次，共灌根3 次，每次每株灌根10 mL 孢子悬浮液，以灌无菌水作为对照，统一定期浇水。各处理15 盆，15 d 后统计相关生长和生理指标。

生长指标测定，株高：子叶节到生长点的长度，单位cm，用游标卡尺测定；茎粗：子叶节的粗度，单位cm，用游标卡尺测定；根长：根基部到最长须根之间的距离，单位cm，用游标卡尺测定；植株鲜质量和干质量：植株用清水反复清洗，再用吸水纸充分吸干水分，测定鲜质量，测定完鲜质量后，将植株放置于105 ℃烘箱中杀青15 min 后，在80 ℃恒温烘箱下烘至恒重，用千分之一电子天平测定干质量和鲜质量。

生理指标测定，叶绿素含量：利用叶绿素测定仪测定叶片的SPAD 值；根系活力：采用TTC 法测定。

1.6 数据分析

采用Excel 2010 进行数据处理，并采用SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析，应用Duncan 新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 木霉菌与植物病原真菌平板对峙试验

由表1 和图1 可知，深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 对7 种病原菌均具有一定的抑菌效果。其中深绿木霉T1 对玉米叶枯病菌抑菌效果最好，抑菌率为86.16%。哈茨木霉T21 对7 种病原菌的抑菌率均在80%以上，其中对芒果炭疽病菌的抑菌效果最好，抑菌率为91.82%。哈茨木霉T21 对7 种病原菌的平板对峙效果均高于深绿木霉T1，说明哈茨木霉T21 在对峙培养中对病原菌的抑制效果强于深绿木霉T1。这可能是因为哈茨木霉T21 在PDA 上生长速度极快，能够迅速占据空间从而达到抑菌效果。其次哈茨木霉T21 能够在与病原菌接触后，产生黄色色素或直接利用病原菌菌丝进行生长，说明哈茨木霉T21 能够产生抑菌代谢产物并且能够寄生于病原菌菌丝。

图1 木霉菌对病原菌的平板对峙结果

表1 木霉菌对病原菌的平板对峙结果

2.2 木霉菌挥发性代谢产物对植物病原菌的抑菌效果

由表2 可知，深绿木霉T1 的挥发性代谢产物对7 种病原菌均具有一定的抑菌活性。其中，深绿木霉T1 对玉米穗腐病菌的抑菌效果最差，抑菌率为39.78%；对芒果炭疽病菌的抑菌效果最好，抑菌率为76.78%。哈茨木霉T21 的挥发性代谢产物对7 种病原菌均没有抑菌效果，可能是因为哈茨木霉T21 挥发性物质中并没有对病原菌有抑制作用的物质。

表2 木霉挥发性代谢产物抑菌效果

2.3 木霉菌非挥发性代谢产物对植物病原菌的抑菌效果

2.3.1 木霉非挥发性代谢产物对植物病原菌菌丝生长的影响 由表3 可知，深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 的非挥发性代谢产物均对7 种病原菌均具有一定的抑菌活性。其中，深绿木霉T1 对番茄早疫病菌的抑制效果最好，抑菌率为75.22%；哈茨木霉T21对番茄枯萎病菌抑菌效果最好，抑菌率为79.21%。

表3 木霉非挥发性代谢产物抑制病原菌菌丝生长效果

2.3.2 木霉非挥发性代谢产物对植物病原菌孢子萌发的影响 由表4 可知，深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 的非挥发性代谢产物对7 种病原菌均具有一定的抑制效果。其中，深绿木霉T1 对番茄枯萎病菌孢子萌发抑制率最高，可达76.69%，其对番茄早疫病菌和芒果炭疽病菌的孢子萌发抑制率也均达到70%以上；哈茨木霉T21 对番茄枯萎病菌孢子萌发抑制率最高，可达100%，其对玉米穗腐病菌和芒果炭疽病菌也具有较好的孢子抑制萌发率，抑制率可达98.07%，97.41%。

表4 木霉非挥发性代谢产物抑制病原菌孢子萌发效果

2.4 木霉菌对番茄幼苗的促生效果研究

2.4.1 木霉菌对番茄幼苗生长指标的促生效果研究由表5 和图2 可知，经过深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 灌根后，在株高方面，经哈茨木霉T21 和深绿木霉T1 处理后的番茄幼苗株高分别达到13.10，11.80 cm，相较于对照处理分别提高29.19%，16.37%；在根长方面，经哈茨木霉T21 和深绿木霉T1 处理后的番茄根长分别达到23.41，22.22 cm，相较于对照处理分别提高42.14%，34.91%；在茎粗方面，经哈茨木霉T21 和深绿木霉T1 处理后的番茄茎粗分别达到0.56，0.53 cm，相较于对照处理分别提高14.59%，8.16%；在植株鲜质量方面，经哈茨木霉T21 和深绿木霉T1 处理后的番茄植株鲜质量分别达到19.05，16.01 g，相较于对照处理分别提高55.00%，30.27%；在植株干质量方面，经哈茨木霉T21 和深绿木霉T1 处理后的番茄植株干质量分别达到1.92，1.30 g，相较于对照处理分别提高69.91%，15.04%。

表5 木霉灌根处理下番茄幼苗的生长指标

图2 木霉菌对番茄幼苗的促生效果研究

2.4.2 木霉菌对番茄幼苗生理指标的促生效果研究由表6 可知，在根系活力方面，经哈茨木霉T21 处理的番茄幼苗根系活力达到2.26 mg·g·h，显著高于深绿木霉T1 处理和对照处理，相较于对照处理提高69.92%，深绿木霉T1 处理和对照处理之间在番茄幼苗根系活力方面无显著性差异；在SPAD 方面，经哈茨木霉T21 和深绿木霉T1 处理的番茄幼苗叶片SPAD 值均显著高于对照处理，相较对照处理分别提高20.97%，20.75%。

表6 木霉灌根处理下番茄幼苗的生理指标

3 结论与讨论

本文研究了深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 对7种病原菌的抑菌活性以及对番茄幼苗生长的影响。研究发现，深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 在平板对峙试验中，均能够占据营养空间从而达到抑菌目的，其中哈茨木霉T21 对7 种病原菌的抑菌活性均高于深绿木霉T1，说明哈茨木霉T21 在平板对峙试验中的抑菌效果优于深绿木霉T1。在挥发性代谢产物抑菌试验中，深绿木霉T1 对7 种病原菌均表现出一定的抑菌活性，而哈茨木霉T21 的挥发性代谢产物并没有抑菌活性，说明深绿木霉T1 在挥发性物质上的抑菌能力高于哈茨木霉T21。在非挥发性代谢产物试验中，深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 对7种病原菌均表现出一定的抑菌活性，说明2 株木霉的非挥发性代谢产物中均存在抑制病原菌菌丝生长和病原菌孢子萌发的物质。在对番茄幼苗的促生试验中，深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 对番茄幼苗的相关生长指标和生理指标均有促进作用，说明在温室连作土壤状态下，深绿木霉T1 和哈茨木霉T21均对番茄具有促生效果。

木霉菌具有多种生防机理，且多种生防机理相互配合。刘佳等利用平板对峙和木霉代谢产物的活性测定长枝木霉T6 对黄瓜枯萎病的抑菌效果，并经过室内防效测定其生防效果，结果发现,长枝木霉T6 对黄瓜枯萎病的室内盆栽防效为69.06%，具有较好的生防效果。王子晴等通过测定木霉对菌核病菌的MDA 含量、CAT 活性、SOD 活性和POD活性，结果发现,经过木霉处理后，菌核病菌的MDA含量显著增加、CAT、SOD 和POD 活性均有所下降，表明木霉处理能够使病原菌氧自由基增加，抗氧化系统破坏，最终导致病原菌死亡。陈迪等通过测定木霉几丁质酶的活性来分析生防木霉菌株的抑菌活性。由于几丁质是病原菌细胞壁的主要成分，生防木霉菌可以通过分泌几丁质酶来裂解病原菌细胞壁从而使其死亡。据相关文献显示，木霉能够产生70 种以上次级代谢产物，包括烃类、醇类、内酯、呋喃烷、酮类、醛类、酯类、芳香族化合物、杂环化合物和各种萜类化合物以及木霉素、抗菌肽和胶霉素等抗生素。这些次级代谢产物在木霉生物防治过程中发挥了重要的作用。本研究发现，深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 的平板对峙及代谢产物对7 种病原菌均具有较好的效果，可能是因为深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 可以通过空间营养竞争以及产生次级代谢产物等生防机理协同拮抗病原菌。但本研究未能分析具体是哪一种次级代谢产物发挥了抑菌作用，也未能测定深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 的室外生防潜力，只测定出深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 具有较好的离体抑菌效果。这些都是今后要深入研究的方向。

促生作用也是木霉菌生防机理的一个重要方面，因为木霉菌本身就是一种重要的植物根际共生微生物，所以木霉对很多植物都具有促生效果。许多木霉可以产生植物激素（生长素、赤霉素），以及产生1-氨基环丙烷-1 羧酸脱氨酶（ACC）调节植物体内乙烯水平。另外，木霉菌可以产生次级代谢产物来刺激植物生长发育。Vinale 等发现，经哈茨木霉（） 的非挥发性代谢产物harzianum acid 处理番茄后，显著促进了番茄幼苗的生长，提高种子发芽率。Ruocco 等发现，经长枝木霉（）的非挥发性代谢产物Hydrophobin 处理烟草和番茄后，诱导并激活了烟草和番茄体内防御相关反应，包括产生活性氧（ROS）和其他化合物，并刺激植物根的形成和生长。本研究采用的土壤为温室番茄连作土壤，结果发现，经过深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 处理后，番茄相关生长和生理指标均高于对照处理，说明深绿木霉T1 和哈茨木霉T21 具有较好的促生效果，但未能研究2 株木霉对番茄幼苗的促生机理，这也是今后要深入研究的方向。