泉州市平菇木霉病菌的分离及鉴定

蓝波妙

（泉州市农业科学研究所 福建泉州 362212）

平菇（Pleurotus ostreatus）属于侧耳科（Pleurotaceae）侧耳属（Pleurotus）[1]，可人工栽培，多见于温带至亚热带地区。平菇营养价值高，含有多种氨基酸、维生素、矿物质及碳水化合物，除食用价值外，还具有很好的药理作用，可以降血脂，保肝解毒，其含有的菌类多糖能够消灭肿瘤细胞[2]。在平菇栽培过程中，常发生病害，引起平菇发生病害的微生物主要包括真菌、细菌、病毒等，其中木霉是平菇生产过程中较常见且危害较大的真菌之一[3-5]。木霉（Trichoderma）是无性型真菌，属于半知菌类的丝孢菌纲（Hyphomycetes），肉座菌科（Hypocreaceae）的肉座菌属（Hypocrea Fr）。1996年Rifai首次对木霉属进行系统分类，将木霉属分为9个复合种，分别是绿色木霉（T.viride）、康氏木霉（T.koningii）、黄绿木霉（T.aureovirid）、哈茨木霉（T.harzianum）、长枝木霉（T.longibrachiatum）、拟康氏木霉（T.pseudokoningii）、钩状木霉（T.hamatum）、多孢木霉（T.polysporum）和小球木霉（T.piluliferm）。Bissett根据木霉菌的性状特征并结合前人的研究结果，提出了一个新的分类系统，引进了组（section）的概念，将木霉属重新划分成了 5个组：长枝组（Longibraehiatum）、土星孢组（Satumisporum）、木霉组（Trichoderma）、厚基组（Paehybasium）和肉座组（Hypocreaum）。我国对木霉属真菌的分类研究，大多集中在对木霉应用的开发上。1993年，文成敬等[6]从西南地区的土壤中分离鉴定出9个木霉种，分别是哈茨木霉（T.harzianum）、拟康氏木霉（T.pseudokoningii）、长枝木霉（T.longibrachiatum）、深绿木霉（T.atroviride），桔绿木霉（T.citrinoviride）、绿色木霉（T.viride）、钩状木霉（T.hamatum）、康氏木霉（T.koningii）及黄绿木霉（T.aureovirid）。2005年，章初龙等[7]从河北、浙江及云南等地分离到了8个已知种的木霉菌，4个新纪录木霉种，包括棘孢木霉（T.asperllum）、淡黄木霉（T.cerinum）、螺旋木霉（T.spirale）、茸状木霉（T.veletinum）。2006年，孙军等[8]从辽宁省的土样和植物组织中分离鉴定出了 12种木霉，其中 11种为已知种，长孢木霉（T.longipilis）为中国新纪录种。据报道，危害香菇、平菇等食用菌的木霉种类主要有哈茨木霉、康氏木霉、绿色木霉和长枝木霉[9-14]等。

目前对食用菌木霉病害的鉴定主要是采用形态学和分子生物学相结合的方法。形态学观察包括菌落形态、生长速率、有无挥发性气体产生等；木霉分子生物学鉴定主要是根据真菌核酸序列的rDNA在18S和28S区域具有保守性，在ITS区段又存在着水平上的差异，通过对ITS区进行扩增测序来检测真菌。Kim等[15]运用形态学和 ITS结合的方法在培养香菇的椴木上鉴定出一种新木霉T.mienum。张广志等[16]利用形态学和ITS序列比对分析相结合的方法从阿魏菇腐烂菌盖上分离出一株侧耳木霉。程丽云等[17]利用形态学和分子生物学相结合的方法从福建的食用菌及土壤中分离得到125株木霉，鉴定出5个种。2010年李广记等[18]通过ITS序列和形态学分类方法对华东地区采集到的木霉菌株进行鉴定，得到一株拟康氏木霉（T.koningiopsis）。

近年来，泉州市食用菌产业规模不断发展壮大，平菇逐渐形成规模化生产，但平菇病害发生严重，影响平菇产业的发展，给菇农造成较大损失。其中，木霉病发病速度快，可造成严重减产或使平菇失去商业价值。木霉种类多，不同地区木霉的优势种类不同，不能进行有效的针对性的治理。关于泉州市平菇木霉菌的主要种类尚未见报道，笔者将传统的形态学和现代分子生物学手段相结合，对平菇木霉菌进行菌种鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

PDA固体培养基：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，20 g琼脂，pH 6.8~7.0，121℃灭菌30 min；PDA液体培养基：PDA固体培养基中不加琼脂。

1.2 方法

1.2.1 平菇病害样品采集2020年分别于泉州市惠安县和丰泽区等地的平菇工厂观察病害症状，随机采集样品，进行分离实验。

1.2.2 病原菌的分离纯化打开超净工作台紫外灭菌20 min，关闭紫外后通风5 min；点燃酒精灯，烧热接种环，待凉后用接种环刮取发病部位霉层，采用平板划线的方法进行分离，在培养皿上做好标记，贴好封口膜，放置于28℃的恒温箱中培养；48 h后等菌丝长出后再进行纯化，如此重复纯化3~4次后，将得到的病原菌株转接于PDA斜面上，待菌落较为丰满或有大量孢子产生时放于 4℃冰箱保存[19]。

1.2.3 形态特征观察及性状测定将分离到的菌株接种到 PDA固体培养基平板上，于 28℃培养48 h后，观察菌落形态，颜色反应，菌体大小。

1.2.4 16 S rDNA分子鉴定

1.2.4 .1 基因组 DNA 提取将分离出来的致病菌接种于PDA液体培养基上，放置于120 r/min的摇床上培养过夜，取培养好的菌液以100 000 g室温下离心 30 s，收集沉淀的菌体，按照生工SK1201-UNIQ-10柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程有限公司）说明书提取基因组DNA。

1.2.4 .2 PCR扩增及产物测序引物序列：7F（5′CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′），1540R（1522）（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′），由上海生工生物工程有限公司提供。

PCR反应体系（50 µL）：1 µL基因组 DNA（10 pmol），引物各 1 µL（10 µmol/L），1 µL dNTPs（10 mmol/L），5 µL 10×PCRbuffer，0.25 µL Taq DNA 聚合酶（5 U/µL），加水至 50 µL。

PCR反应条件：98℃预变性5 min；95℃变性35 s，55℃退火35 s，72℃延伸90 s，35个循环，72℃终延伸8 min。

PCR产物委托上海生工生物技术公司进行纯化和序列测定。将测序结果与NCBI GenBank数据库进行blast比对，得出单克隆菌株所属分类地位。选取每个单克隆菌株的近缘序列，利用MEGA5.0软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 泉州市平菇病害发生情况

2020年4月至2020年10月对泉州市惠安、丰泽等地的菇厂进行病害调查，发现竞争性真菌病害普遍发生，危害严重。通过本次调查可知，泉州市平菇真菌性病害主要表现为平菇菌袋或培养料受到病原菌的污染，平菇菌丝不能正常生长（图1）。

图1 平菇病害症状

2.2 病原菌的鉴定

2.2.1 病原菌的形态鉴定经菌落形态观察，本次分离到3种真菌。其主要形态特征如下：

菌株P1在PDA平板上，菌落生长迅速，致密棉絮状。菌落起初为白色，培养时间延长 3 d后菌落颜色逐渐变为浅绿色，反面为无色（图2）。菌株P1形态特征与John Bisset[20]和张广志等[21]描述的里氏木霉一致，故将菌株P1初步鉴定为里氏木霉（Trichoderma reesei）。

图2 菌株P1（里氏木霉）

菌株P2在PDA平板上，菌落迅速生长，培养 2~3 d后，可产生簇状白色气生菌丝；菌落刚开始培养时表现为白色，后转变为淡绿色，培养3 d后表现为墨绿色，在产孢簇边缘形成白色流苏状菌丝（图3）。菌株 P2的形态特征与 John Bissett[22]及张广志等[21]对侧耳木霉（Trichoderma pleuroticola）的描述一致，因此初步将菌株P2鉴定为侧耳木霉（Trichoderma pleuroticola）。

图3 菌株P2（侧耳木霉）

菌株P3在PDA平板上生长迅速，菌丝初期呈白色毛毡状，3 d后产孢并变为浅绿色；菌落老熟时为茶绿色，背面由白色变为黄色（图4）。菌株P3与Bissett[23]描述的长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）的形态结构一致，故将菌株 P3初步鉴定为长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。

图4 菌株P3（长枝木霉）

2.2.2 木霉菌序列比对与系统发育分析将分离纯化后的菌株P1、P2、P3提取基因组DNA后，利用PCR对其ITS片段进行扩增，测序得到3条不同的碱基序列；将3条序列在NCBI数据库中进行Blast序列检索（表1）；各选取2个相似度较高的序列，构建系统发育树（图5）。根据Bissett系统的分组情况，并结合进化树可以看出，P1菌株的序列与里氏木霉（Trichoderma reesei）的遗传距离最近，P2菌株与侧耳木霉（Trichoderma pleuroticola）的遗传距离最近，P3菌株与长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）的遗传距离最近，都各自聚在一个小分枝里；因此，结合其形态特征和ITS序列系统发育分析结果，将菌株P1鉴定为里氏木霉（Trichoderma reesei），菌株 P2鉴定为侧耳木霉（Trichoderma pleuroticola），菌株 P3鉴定为长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。菌株P1所处的这个分枝与P3的分枝聚在一起，共同属于长枝组（set.longibachiatum），P2菌株所在的小分枝则属于厚基孢组（set.pachybasium）。

表1 平菇木霉病菌16S rDNA序列的Blast比对结果

图5 三株木霉ITS系统进化树

3 讨论

平菇为木腐生营养型的食用菌，主要以多种含有纤维素、半纤维素以及木质素成分的玉米芯、稻草等为培养料。绝大多数的木霉是纤维素酶的生产菌株，因此，木霉成为食用菌生产中主要的栽培料污染菌；同时，食用菌的栽培料也有适于木霉的生长。泉州夏天高温时间较长，平菇病虫危害严重，有的菇厂木霉污染率高达90%以上，菇农损失惨重。为了分离与鉴定危害平菇的病菌，明确危害菌的种类，笔者利用纯培养特征和分子鉴定相结合的手段，初步确定了泉州地区平菇栽培过程中污染菌的种类，主要有里氏木霉、长枝木霉和侧耳木霉，为有针对性地进行病害防治奠定了基础。由于真菌核酸序列的rDNA在18S和28S区域具有保守性，通过对 ITS区进行扩增测序来检测病原真菌的技术已被广泛应用。

研究鉴定木霉菌属对病害的发生和防治有着重要的作用。泉州属于亚热带季风气候，冬天主要受蒙古冷高压控制，盛行偏北风，气温低，干燥少雨；夏季受副热带高压影响，盛行偏南风，气温高，湿润多雨。泉州夏季高温高湿的天气，有利于木霉病害大面积迅速爆发。因此，确定了木霉病菌的种类，在食用菌病害防治方面更有针对性，并可根据天气合理安排栽培时间，避开病害高发期，或选择抗病品种，加强管理。

随着木霉在工农业生产上的应用越来越多，木霉分类学的研究也越深入[24-25]。本研究旨在明确平菇生产中污染菌木霉的种群结构，从而为木霉病害的安全防治提供理论依据。