缅栀花提取物的挥发性成分鉴定及其葡萄糖转运机制研究

田 迪，陈 锐，朴永革，付 祺，李 锋，李河霖，李宝志，桂明英

1云南农业大学茶学院，昆明 650201；2吉林烟草工业有限责任公司技术中心，长春 130031；3云南省高原特色农业产业研究院，昆明 650201

缅栀花(PlumeriarubraL.var.actifoliaBailey)，因其外形极似蛋白包裹蛋黄而又名鸡蛋花，属竹夹科[1]。缅栀花原产于南美洲，在云南较为常见，云南缅栀花具有清热解毒、利湿、止咳的功效，并且可用来治疗传染性肝炎、支气管炎、肺结核等疾病。环烯醚萜类及苷类化合物是缅栀花主要的功能性成分，由于其具有很强的抗真菌和抗肿瘤活性作用而受到广泛关注[2-4]。糖尿病已成为当前威胁全球人类健康最重要的慢性非传染性疾病之一，并在世界范围内呈流行趋势[5]。最新数据统计，中国糖尿病患者人数达到1.139亿[6]，并产生巨大的医疗经济负担。2型糖尿病病理生理的主要特征是胰岛素抵抗和胰岛素分泌减少[7]，通常胰岛素信号通路的减弱是发生胰岛素抵抗的原因[8,9]，PI3K/Akt信号通路是胰岛素作用的最主要信号通路。Akt蛋白是PI3K信号通路下游的重要靶蛋白，Akt蛋白是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的一种，各种研究表明Akt在细胞的糖代谢、细胞增殖、凋亡方面占据重要作用[10]。目前对缅栀花的研究主要在其挥发油化学成分检测及其药理研究，而缅栀花提取物对骨骼肌细胞Akt调控作用的相关研究鲜有报道[11-14]。有研究表明缅栀花中存在抗糖尿病类异戊二烯和长链δ-内酯对α-葡萄糖苷酶有抑制的活性，茎皮提取物黄酮苷可明显降低四氧嘧啶所致的高血糖大鼠中血清甘油三酯含量，说明缅栀花具有一定的降糖降脂潜力[15,16]。

本研究以缅栀花为实验材料，通过制备缅栀花水提物，探索其是否可以正向调节某一个关键因子如PI3K、Akt/PKB、AS160的磷酸化水平，使其处于活性状态，进而强化GLUT4的转移，以期达到降血糖的效果。旨在为云南地区缅栀花资源促进骨骼肌葡萄糖转运提供理论依据和挖掘其综合药用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 缅栀花

实验用干燥缅栀花材料产自云南省昆明市。

1.1.2 骨骼肌细胞系

C2C12骨骼肌细胞购于ATCC-American type culture collection。

1.1.3 主要实验试剂

胰岛素(江苏万邦，7353789)；青链霉素混合液(Solarbio)；胰蛋白消化酶(碧云天)；DMSO(Solarbio，67-68-5)；磷酸盐缓冲液(Solarbio)；DMEM/HIGHGLUCOSE(Hyclone)；抗体(Cell Signaling Technology)；2-NBDG葡萄糖摄取试剂盒(abcam，ab235976)；甲醇(天津致远，67-56-1)；Meilunbio®飞克特超敏ECL发光液(美仑生物，MA0186)；石油醚(阿拉丁)；乙腈(美国，TEDIA，色谱纯)；三氟乙酸(德国，MERCK，色谱纯)。

1.2 试验方法

1.2.1 缅栀花提取物的制备

打碎：使用破壁粉碎机将干燥缅栀花进行破碎化处理；浸出：按料液比1∶20加入热水，温度保持在75±10 ℃，浸出0.5 h后，使用三层医用纱布进行过滤，滤渣保留，按照1∶20、1∶20、1∶10的料液比反复热水浸出3次，之后将全部滤液合并后做离心处理，取上清液；浓缩：减压浓缩至原液体积的1/8～1/10后，进入-20 ℃冰箱做冷冻处理；干燥：利用真空冷冻干燥机对冷冻浓缩液进行冷冻干燥处理，得到干燥缅栀花水提取物，含水率低于3 %，产率为10～15 %。

1.2.2 使用气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)对缅栀花提取物进行成分测定

仪器：Agilent Technologies-7890A/5975C型气相色谱-质谱仪；色谱柱：Agilent1909 1S-433UI HP(30 m×0.25mm×0.25 μm)石英毛细管柱；载气为He，流速为1.2 mL/min，进样量5 uL，分流比10∶1；程序升温：起始温度为60 ℃，然后以6 ℃/min升到280 ℃，保持6 min，再以10 ℃/min升至300 ℃，保持2 min，运行时间为46.667 min；EI电离源，电离能为70 eV，离子源温度230 ℃；扫描质量范围m/z：35～550 amu。

1.2.3 细胞培养条件

在细胞培养板中使用含10%牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)高糖配方培养液对接种后的C2C12细胞进行培养，至70～80 %细胞出现汇合时换培养液，添加新的培养液前需使用PBS进行1～2次清洗，之后再新加入含有2 %马血清的DMEM培养液使细胞分化，体外分化培养C2C12细胞4～5天后，进行饥饿处理后加药，实验分为空白对照组(0 mg/mL)和不同浓度缅栀花提取物组，浓度分别为1、2、4、8 mg/mL。

1.2.4 免疫印迹试验(Western blot)检测

在10 %的SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶上配制8 %的凝胶，添加经过蛋白定量后的样本，恒压电泳1.5 h后，将蛋白转膜到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上，5%BSA封闭1 h。1∶1 000稀释一抗抗体，封闭后加入一抗抗体4 ℃摇床8 h，PBST缓冲液洗膜3～4次，每次10 min。之后在封闭液中加入二抗抗体(1∶10 000)辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体，室温摇床1.5 h。再用PBST洗膜3次，每次10 min。经过化学发光试剂显色，在曝光机中进行曝光，扫描或拍照后，用图像处理系统分析目标分子量条带进行数字化分析处理。

1.2.5 葡萄糖摄取测定(2-NBDG法)

分化后的C2C12细胞设置为空白对照组(control)、缅栀花提取物组(PE)和胰岛素阳性对照组(insulin)，使用荧光葡萄糖类似物2-NBDG葡萄糖摄取试剂盒，分别加入2-NBDG低糖培养基后，用荧光酶标仪测定细胞在485 nm激发波长和538 nm发射波长下的荧光强度，对照组2-NBDG摄取率为100%，以2-NBDG为探针计算不同条件下细胞葡萄糖摄取率。

1.2.6 数据分析

采用SPSS统计软件ANOVA进行显著性分析，P<0.05视为有显著性差异，P<0.01视为有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 缅栀花提取物的主要成分

经GC-MS检测所得的质谱信息，缅栀花提取物实验分析结果见图1，应用谱库检索并参考有关文献[17]，鉴定了缅栀花提取物中含有12个主要成分。

图1 缅栀花提取物GC-MS实验结果Fig.1 Results of GC-MS experiment on Plumeria water extract

有研究表明，植物酚酸类、萜类物质具有明显的降糖作用[18,19]。由表1可知，对缅栀花挥发油中主要化学成分的分离鉴定表明主要成分为31.16%的十六酸(n-hexadecanoic acid)，肉豆蔻酸(tetradecanoic acid)含量为15.02%，9，12-十八碳二烯酸(9,12-octadecadienoic acid)含量为11.01%，还包含其他脂肪酸，酚类，酯类，烷烃类，萜类等成分，说明鸡蛋花挥发油中主要成分为脂肪酸和萜类化合物，其中脂肪酸为十六酸、肉豆蔻酸等，占挥发油总量的46%，萜类化合物主要为1，6，10-十二碳三烯-3-醇、2，6，10-十二碳三烯-1-醇和双十六烷硫醇等，这些成分可能与缅栀花发挥功能性作用相关。从总的结果来分析，主要成分与文献报道的基本一致[20]，但在相同成分含量上却存在差异，这可能与鸡蛋花产地的土壤性质、地理环境、采摘时间以及测试条件有一定关系。

续表1(Continued Tab.1)

2.2 缅栀花提取物对C2C12细胞生长状态的影响

由图2知，不同缅栀花提取物(PE)浓度培养C2C12细胞4 h后，与对照组相比较，不同浓度PE对C2C12细胞增殖情况无明显影响，未发现促细胞凋亡现象，细胞生长状态正常。

图2 缅栀花提取物浓度对C2C12细胞存活率的影响Fig.2 The effect of PE concentration on C2C12 cell vitality

2.3 缅栀花提取物对C2C12细胞中葡萄糖摄取量和对蛋白激酶B(Akt)的调控作用

为了测定不同浓度PE对C2C12细胞中Akt的调控作用，使用PE浓度梯度为1、2、4、8 mg/mL处理之后，以Western blot法检测Akt磷酸化水平。结果显示，当PE浓度为1 mg/mL时，对Akt磷酸化的促进效果不明显，而PE浓度为2 mg/mL时，对C2C12细胞Akt磷酸化促进效果显著(P<0.05)，当PE浓度为2 mg/mL时，对C2C12细胞Akt磷酸化有极显著促进效果，当PE浓度为4 mg/mL时，达到最大促进效果(P<0.01)，而在PE浓度增加到8 mg/mL时效果稍有减缓，因此我们选择将4 mg/mL浓度作为PE正向调控C2C12细胞Akt磷酸化水平的最适剂量(见图3B)。

在确定最适剂量后，为了确定PE最适处理时间，确定的最适剂量为4 mg/mL浓度的基础上，选取15、30、45、60 min四个时间梯度进行处理，同样以Western blot法检测C2C12细胞中Akt的磷酸化水平。结果表明，当处理时间为15 min时，对Akt磷酸化有一定的促进效果(P<0.05)，处理时间为30 min时，对C2C12细胞Akt磷酸化达到最大促进效果(P<0.01)，而在处理时间为45 min和60 min时，Akt磷酸化的促进效果基本持平，并略有减缓，因此选择将30 min作为PE正向调控C2C12细胞Akt磷酸化水平的最适处理时间(见图3C)。

图3 确定PE对C2C12细胞中Akt磷酸化正向调控作用的最适剂量和时间Fig.3 Determine the optimal dose and time of PE on the positive regulation of p-Akt in C2C12 cells注：与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。下同。Note：Compared with control group,*P<0.5, **P<0.01,***P<0.001.The same below.

有研究表面表明，Akt是胰岛素刺激葡萄糖转运信号通路中的关键分子[21]，能增强葡萄糖转运和代谢，同时腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK)和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)也是与葡萄糖转运和糖脂代谢密切相关的酶。

在诸多前期研究中，在此胰岛素(insulin，1 μL/mL,30 min)作用实验条件下[22]，骨骼肌的Akt磷酸化水平显著增高，因此可以作为可靠的阳性对照使用，所以本文选取胰岛素(insulin，1 μL/mL,30 min)作为阳性对照，通过PE(4 mg/mL,30 min)处理C2C12细胞，与对照组相比，C2C12细胞再经过PE处理后Akt磷酸化水平显著增加，同在葡萄糖转运信号通路下游的Akt底物(A 160 kDa substrate of the Akt Ser/Thr kinase，AS160)的磷酸化水平也明显增加(见图4C、4D)。为了考察PE的降糖活性，通过2-NBDG法检测细胞对葡萄糖的摄取量，如图4A示，与对照组相比，C2C12细胞再经过PE(4 mg/mL、30 min)处理后对葡萄糖摄取量显著提高，葡萄糖摄取量提高了1.65倍。

图4 PE促进C2C12细胞的葡萄糖吸收和刺激Akt、AS160的磷酸化水平Fig.4 PE promotes glucose uptake in C2C12 cells and stimulates the phosphorylation of Akt and AS160

我们又选取和咖啡因(caffeine，1 mg/mL,30 min)作为阳性对照，验证了PE(4 mg/mL,30 min)对AMPK和ACC的磷酸化水平的影响(见图5)，通过实验我们发现PE对AMPK和ACC磷酸化水平没有影响。

图5 PE对C2C12细胞P-AMPK和P-ACC的影响Fig.5 The effect of PE on P-AMPK and P-ACC in C2C12 cells

2.4 缅栀花提取物与胰岛素的协同作用

胰岛素注射是当前糖尿病治疗的主要方法，而通过实验发现PE与胰岛素都具有正向调控Akt磷酸水平的作用后，下一步，我们对PE是否有可能与胰岛素发生协同作用进行了验证。实验结果表明，经PE(4 mg/mL,30 min)和胰岛素(insulin，1 μL/mL,30 min)单独处理后C2C12细胞中Akt磷酸化水平与对照组相比有显著上升(P<0.01)。PE和胰岛素协同作用组(PE，4 mg/mL,30 min+insulin，1 μL/mL,30 min)比PE和胰岛素单独处理组又有了显著上升(P<0.01)，这个结果说明，PE和胰岛素都能够有效正向调控C2C12细胞Akt的磷酸化水平，同时PE和胰岛素还表现出了良好的协同作用效果(见图6A、6B)。

图6 PE与胰岛素的协同作用Fig.6 The synergistic effect of PE and insulin

3 讨论与结论

本实验通过GC-MS检测了缅栀花提取物，对缅栀花挥发油中主要化学成分的分离鉴定，检测出脂肪酸、酯类、烷烃类、萜类等12种主要成分，其中含量较多为十六酸、肉豆蔻酸等。目前已有相关文献报道，酚类、萜类、烷烃类物质具有明显的降糖作用，缅栀花中含有这些成分，可能是这些成分对于降糖产生了一定效果。对缅栀花挥发油的成分和组成的研究结果进行报道，为其进一步开发应用打下基础。

通过实验，发现在研究中选取的PE浓度范围，未对C2C12细胞的生长和状态带来毒副影响，在各组细胞数量基本一致的情况下，可以排除细胞状态异常带来的极端影响，所取得的数据可信度较高。C2C12细胞中的Akt在糖转运和代谢信号转导中发挥重要作用，PI3K/Akt/GlUT4途径被公认为是体内胰岛素介导糖摄取的主要信号通路之一[23]。AMPK作为细胞内能量水平的感受器，当细胞内能量水平降低时，AMPK通过磷酸化机制被激活，促进细胞葡萄糖转运子向细胞膜易位，通过向细胞内转运葡萄糖来维持细胞能量水平，ACC为AMPK的下游因子。因此，我们也对与葡萄糖转运信号通路相关的AMPK以及ACC等关键酶是否也受到PE的影响进行了进一步的验证，结果PE处理对C2C12细胞中的AMPK和ACC没有影响。

PE对C2C12细胞中的Akt具有正向调控作用，与Akt分子有紧密调控关系，这与胰岛素依赖性糖转运信号通路的机动机制相似，因此，我们对PE与胰岛素的协同作用也进行了探究。经过实验验证了PE与胰岛素联用后，对Akt的刺激作用均强于PE或胰岛素单独作用，显示了较好协同效应，从正向调控C2C12细胞中Akt活性的角度，明确了PE具有与胰岛素类似或者提升胰岛素敏感性的作用，提供了缅栀花在医药健康领域应用基础研究依据。

目前，对缅栀花化学成分、功效、加工方法的方面的研究还比较有限，本研究通过缅栀花水提物的成分分析，鉴定分离缅栀花的主要成分及含量，并发现了缅栀花提取物对C2C12细胞Akt磷酸化水平的正向调控作用，明确了缅栀花水提物与胰岛素的协同作用，为缅栀花在医药和保健品方面的应用提供了一定的理论依据和新的开发思路。