绳生毛壳霉CIB-604次级代谢产物及生物活性研究

张 霞，钱雪情，刘玲艳，秦张一，杨 涛，李国友

1中国科学院成都生物研究所，成都 610041；2中国科学院大学，北京 100049

毛壳菌属真菌(Chaetomium)属于子囊菌纲(Ascomycetes)球壳菌目(Sphaeriales)毛壳菌科(Chaetomiaceae)，广泛存在于空气、土壤及生物有机体中，目前已有400多个种被报道[1]。既往研究表明，毛壳菌属真菌能够产生结构类型丰富的次级代谢产物，其中以细胞松弛素和azaphilone类化合物为主要类型[2]，同时毛壳菌属真菌次级代谢产物具有广泛的生物活性，如抗菌[3-5]、抗炎[1,6]、细胞毒[7-11]等。本课题组长期致力于毛壳菌属真菌次级代谢产物发现及其生物活性研究，先后从螺卷毛壳(C.cochliodes)[12,13]、反卷毛壳(C.convolutum)[14]、球毛壳(C.globosumCIB-160)[15]、细丽毛壳(C.gracile)[16]等毛壳霉次级代谢产物中分离到了多种不同结构类型的活性物质。绳生毛壳霉(C.funicola)是一株潜在病原菌，曾在被感染的皮肤组织中发现过[17]。1969年报道了从绳生毛壳霉分到的1个大环二内酯化合物[18]，1987年，Itoh等[19]从C.funicolaJS 525分离到了泛醌类化合物。目前关于绳生毛壳次级代谢产物研究报道仅有上述两篇，同时缺乏相关生物活性研究报道。本文对一株绳生毛壳霉(C.funicolaCIB-604)的次级代谢产物进行了系统研究，并对部分化合物进行了抑菌活性和细胞毒活性测试。在此，我们将对该菌次级代谢产物的结构及生物活性进行报道。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 实验仪器

AVANCE 400型、600型核磁共振仪(德国Bruker公司)；MicrOTOF-QII高分辨质谱仪(德国Bruker公司)；半制备色谱柱(250 mm×21.2 mm，10 μm，苏州纳微生物科技有限公司；250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司)；半制备液相色谱仪(伍丰LC-100)；高效液相色谱仪(江苏汉邦科技有限公司)；Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪、Attune NxT流式细胞仪(美国Thermo Fisher Scientific)。

1.1.2 试剂与材料

乙腈、二氯乙烷、甲醇、石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂(成都力信和化工)，工业级，重蒸后使用；柱色谱硅胶(100～200、200～300目)及薄层色谱硅胶(GF254)(青岛海洋化工厂)；反相C18硅胶(苏州纳微生物科技有限公司)；Sephadex LH-20(GE Healthcare Bio-Sciences AB)；氘代试剂CDCl3、CD3OD、DMSO-d6等(美国Sigma-Aldrich)；TLC显色剂为5%硫酸-乙醇溶液；氨苄青霉素、氟康唑(上海麦克林生化科技有限公司)；DEME培养基、双抗、胎牛血清、胰酶(Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(中国凯基生物公司)。

1.1.3 菌株及细胞株

真菌CIB-604由本实验室从土壤样本中分离得到，并从形态学及分子生物学角度进行了鉴定。在PDA平皿上，CIB-604的菌落具白色气生菌丝，日生长速率3～4 mm；第3天开始产褐色至黑色子囊果，椭圆形或近球形，凭借假根固着于培养基表面；子囊果附属丝多顶生，挺直、刚毛状，向顶部渐细，呈暗褐色，具隔；子囊孢子卵形或椭圆形，呈褐色，细小端具单个顶生芽孔。同时将CIB-604的ITS扩增序列结果提交到NCBI进行同源比对，使用MEGA7.0构建系统发育树(邻接法)，CIB-604与Chaetomiumfunicola聚为一支。结合形态学鉴定结果，将CIB-604鉴定为绳生毛壳霉(C.funicola)。

绳生毛壳霉(C.funicolaCIB-604)以及用于抑菌实验的大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)均保存于中科院成都生物研究所。人肿瘤细胞株SK-Hep-1、A549、HCT-116和MCF-7购买自美国ATCC公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵

液体培养基：改良后的PDB培养基，土豆200 g，葡萄糖20 g，酵母膏1.5 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，水1 000 mL。121 ℃灭菌30 min。

发酵培养基：大米加2倍体积的水浸泡过夜后，过滤并分装于500 mL三角瓶中，并加入0.3%的蛋白胨。121 ℃灭菌30 min。

绳生毛壳霉CIB-604接种于PDA斜面，30 ℃恒温培养5天进行活化，再转接于液体培养基中，30 ℃、150 rpm条件下培养3天。将长好的种子液转接于大米固体培养基中，30 ℃下静止培养30天。

1.2.2 提取与分离

绳生毛壳霉CIB-604大米固体发酵物共10 kg，用乙酸乙酯(20 L)浸提(60 ℃)3次，每次24 h，合并滤液后减压浓缩得到浸膏78.1 g。总浸膏经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱(30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1，V/V)，经TLC分析合并为8个部分(A～H)。E段(4.95 g)再次经硅胶柱层析分离得到8个亚组分(E1～E8)，化合物7(21.4 mg)、8(14.9 mg)分别从E4、E6段析出后重结晶得到。G段(3.79 g)进一步通过反相硅胶柱分离，以甲醇-水(20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、80∶20、100∶0，V/V)洗脱分离得到14个亚组分(G1～G14)，G2段(51.3 mg)通过Sephadex LH-20柱(VEDC∶VMeOH= 1∶1)分为G2-1～G2-4四个部分，G2-2(37.0 mg)进一步以20%乙腈水(V/V，含0.3‰三氟乙酸)为洗脱剂，经半制备液相柱(10 mL/min)分离得到化合物1(5.7 mg，tR= 15.5 min)和化合物3(4.7 mg，tR= 9.8 min)。G5段(35.6 mg)经半制备HPLC(10 mL/min，27%乙腈水，V/V)分离得到化合物2(13.0 mg，tR= 23.2 min)。G13(196.8 mg)再次经正相硅胶柱分离得到7个组分(G13-1～G13-7)，G13-2段(47.7 mg)进一步通过半制备液相柱(10 mL/min，86%乙腈水，V/V)得到化合物4(7.7 mg，tR= 52.9 min)、5(12 mg，tR= 69.4 min)、6(4.5 mg，tR= 73.6 min)。

1.2.3 抑菌活性测试

采用双层琼脂扩散法[20]考察化合物1～6对两株细菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)以及一株真菌(白色念珠菌)的抑制活性。细菌培养基为LB培养基，真菌培养基为PDA培养基。样品用DMSO溶解并配制成0.1 mg/mL，在对应孔中加入180 μL。阴性对照为DMSO；细菌阳性对照药物为氨苄青霉素(50 μg/mL)，真菌阳性对照药物为氟康唑(50 μg/mL)。

1.2.4 抗肿瘤活性

1.2.4.1 MTT法检测化合物体外细胞毒活性

采用MTT法测试了部分化合物对人肿瘤细胞株SK-Hep-1、A549、HCT-116和MCF-7的细胞毒活性。细胞株用含10%胎牛血清的DMEM培养基(100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

取对数期的细胞株，按大约3 000细胞/孔的量接种于96孔板，置于37 ℃恒温培养箱中孵育24 h。24 h后，将不同浓度梯度的样品分别加入到培养中，并设置空白对照，置于细胞培养箱中继续培养72 h。再向培养基中加入20 μL MTT培养液(5 mg/mL)染色4 h。移去MTT溶液，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min后，用酶标仪检测在570 nm波长下各孔的吸光值，并计算抑制率及IC50。

1.2.4.2 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数期细胞株，调整细胞密度为3 000/mL，每孔1 mL接种于6孔板中，置于培养箱中培养24 h后，加入样品(浓度为10 μM)处理，每组设置3个复孔。36 h后，胰酶消化细胞，1 500 rpm离心5 min，去除上清液，再用PBS洗2次。检测方法根据试剂盒说明书操作：Binding buffer重悬细胞，先后加入Annexin V和PI，混匀后避光孵育15 min，流式细胞仪测定细胞凋亡率。

2 结果

2.1 化合物结构鉴定

化合物1白色粉末；5%硫酸乙醇不显色；ESI-MS：m/z312.43 [M + Na]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.62(1H，s，H-3)，8.88(1H，s，H-6)，3.15(1H，dd，J=11.6，5.0 Hz，H-11)，1.98(1H，dd，J=12.6，5.0 Hz，H-12)，2.11(1H，t，J= 12.4 Hz，H-12)，2.60(3H，s，H-14)，1.20(3H，s，H-15)，0.76(3H，s，H-16)，0.94(3H，s，H-17)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：76.4(C-1)，153.5(C-2)，118.4(C-3)，165.2(C-4)，146.8(C-6)，124.1(C-7)，197.0(C-8)，68.1(C-9)，48.2(C-10)，69.4(C-11)，45.3(C-12)，207.0(C-13)，24.7(C-14)，11.0(C-15)，14.6(C-16)，21.2(C-17)。以上数据与文献[21]报道基本一致，故鉴定为chaetoindicin A(结构见图1)。

图1 化合物1～8的化学结构Fig.1 The chemical structure of compounds 1-8

化合物2浅黄色粉末；5%硫酸乙醇显色为蓝绿色；ESI-MS：m/z290.35 [M + H]+；1H NMR(400 MHz，C5D5N)δ： 2.63(1H，dd，J=14.6,9.9 Hz，H-1)，3.18(1H，dd，J=14.9,1.0 Hz，H-1)，4.86(1H，dd，J=9.6 ,1.0 Hz，H-2)，9.52(1H，s，H-6)，7.54(1H，s，H-9)，1.49(3H，s，H-11)， 1.71(3H，s，H-12)，2.08(3H，s，H-13)，2.61(3H，s，H-14)；13C NMR(100 MHz，C5D5N)δ：36.1(C-1)，92.3(C-2)，175.4(C-3a)，107.9(C-4)，185.9(C-5)，124.6(C-5a)，148.7(C-6)，162.8(C-8)，121.0(C-9)，149.8(C-9a)，72.2(C-9b)，71.2(C-10)， 28.0(C-11)，27.6(C-12)，8.8(C-13)，25.2(C-14)。以上数据与文献[21]报道基本一致，故鉴定为chaetoindicin B。

化合物3浅黄色粉末；5%硫酸乙醇显色为蓝绿色；ESI-MS：m/z290.32 [M + H]+；1H NMR(400 MHz，C5D5N)δ：2.66(1H，dd，J=12.3,10.1 Hz，H-1)，3.11(1H，dd，J=12.4,4.7 Hz，H-1)，5.38(1H，dd，J=10.0,4.6 Hz，H-2)，9.45(1H，s，H-6)，7.62(1H，s，H-9)，1.47(3H，s，H-11)，1.66(3H，s，H-12)，2.01(3H，s，H-13)，2.63(3H，s，H-14)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：36.8(C-1)，91.8(C-2)，174.9(C-3a)，107.2(C-4)，185.1(C-5)，122.2(C-5a)，148.2(C-6)，162.2(C-8)，120.2(C-9)，149.5(C-9a)，74.2(C-9b)，69.8(C-10)，26.6(C-11)，26.1(C-12)，8.0(C-13)，24.5(C-14)。以上数据与文献[21]报道基本一致，故鉴定为chaetoindicin C。

化合物4白色粉末；5%硫酸乙醇显色为黄色；ESI-MS：m/z467.21 [M + Na]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：3.95(1H，m，H-3)，5.58(1H，d，J= 1.8 Hz，H-7)，2.76(1H，m，H-14)，0.67(3H，s，H-18)，1.00(3H，s，H-19)，1.06(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，5.21(1H，dd，J= 15.2，7.7 Hz，H-22)，5.27(1H，dd，J= 15.2，7.2 Hz，H-23)，0.85(3H，d，J= 7.2 Hz，H-26)，0.87(3H，d，J= 7.3 Hz，H-27)，0.95(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：26.6(C-1)，31.0(C-2)，67.8(C-3)，37.1(C-4)，80.2(C-5)，200.1(C-6)，120.9(C-7)，165.0(C-8)，76.1(C-9)，44.3(C-10)，29.3(C-11)，36.2(C-12)，46.2(C-13)，52.8(C-14)，23.4(C-15)，29.1(C-16)，57.4(C-17)，12.6(C-18)，21.6(C-19)，41.7(C-20)，20.6(C-21)，136.7(C-22)，133.6(C-23)，42.8(C-24)，34.4(C-25)，20.1(C-26)，20.5(C-27)，18.2(C-28)。以上数据与文献[22,23]报道基本一致，故鉴定为(22E,24R)-3β,5α,9α-trihydroxy-ergosta-7,22-dien-6-one。

化合物5无色针晶；5%硫酸乙醇显色为紫红色；ESI-MS：m/z451.24 [M + Na]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.93(1H，m，H-3)，3.31(1H，d，J= 2.6 Hz，H-6)，4.22(1H，br s，H-7)，0.58(3H，s，H-18)，1.14(3H，s，H-19)，1.01(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，5.16(1H，dd，J= 14.8，7.4 Hz，H-22)，5.21(1H，dd，J= 15.3，7.1 Hz，H-23)，0.83(3H，d，J= 6.5 Hz，H-26)，0.81(3H，d，J= 6.6 Hz，H-27)，0.91(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：31.0(C-1)，30.3(C-2)，68.7(C-3)，39.3(C-4)，65.8(C-5)，62.7(C-6)，67.3(C-7)，134.6(C-8)，127.1(C-9)，38.1(C-10)，23.5(C-11)，35.8(C-12)，42.2(C-13)，49.7(C-14)，24.0(C-15)，29.1(C-16)，53.8(C-17)，11.4(C-18)，23.0(C-19)，40.6(C-20)，21.1(C-21)，135.7(C-22)，132.1(C-23)，43.0(C-24)，33.2(C-25)，19.8(C-26)，20.1(C-27)，17.8(C-28)。以上数据与文献[23]报道基本一致，故鉴定为(22E,24R)-5α,6α-epoxy-ergosta-8,22-dien-3β,7α-diol。

化合物6白色粉末；5%硫酸乙醇显色为紫红色；ESI-MS：m/z451.24 [M + Na]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.94(1H，m，H-3)，3.16(1H，d，J= 3.6 Hz，H-6)，4.44(1H，d，J= 3.2 Hz，H-7)，0.89(6H，s，H-18，19)，1.04(3H，d，J= 6.7 Hz，H-21)，5.20(1H，dd，J= 15.2，7.6 Hz，H-22)，5.25(1H，dd，J= 15.2，7.0 Hz，H-23)，0.84(3H，d，J= 6.7 Hz，H-26)，0.86(3H，d，J= 6.7 Hz，H-27)，0.93(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：32.3(C-1)，31.2(C-2)，68.8(C-3)，39.7(C-4)，67.9(C-5)，61.5(C-6)，65.2(C-7)，125.3(C-8)，38.7(C-9)，36.0(C-10)，19.1(C-11)，36.7(C-12)，43.1(C-13)，152.8(C-14)，25.1(C-15)，27.3(C-16)，57.0(C-17)，18.2(C-18)，16.7(C-19)，39.4(C-20)，21.4(C-21)，135.4(C-22)，132.4(C-23)，43.0(C-24)，33.2(C-25)，20.1(C-26)，19.8(C-27)，17.8(C-28)。以上数据与文献[24,25]报道基本一致，故鉴定为5α,6α-epoxy-(22E,24R)-ergosta-8(14),22-diene-3β,7α-diol。

化合物7无色针晶；5%硫酸乙醇显色为紫红色；ESI-MS：m/z397.12 [M + H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：3.64(1H，m，H-3)，5.58(1H，dd，J= 5.4，2.4 Hz，H-6)，5.38(1H，dd，J= 5.5，2.8 Hz，H-7)，0.63(3H，s，H-18)，0.96(3H，s，H-19)，1.03(3H， d，J= 6.7 Hz，H-21)，5.20(1H，dd，J= 15.4，7.6 Hz，H-22)，5.15(1H，dd，J= 15.4，7.6 Hz，H-23)，0.84(3H，d，J= 7.0 Hz，H-26)，0.82(3H，d，J= 7.0 Hz，H-27)，0.92(3H，d，J= 6.6 Hz，H-28)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：38.5(C-1)，32.0(C-2)，70.6(C-3)，41.0(C-4)，139.9(C-5)，119.7(C-6)，116.5(C-7)，141.5(C-8)，46.4(C-9)，37.1(C-10)，21.2(C-11)，39.3(C-12)，43.0(C-13)，54.7(C-14)，23.1(C-15)，28.4(C-16)，55.9(C-17)，12.2(C-18)，16.4(C-19)，40.5(C-20)，21.2(C-21)，135.7(C-22)，132.2(C-23)，42.9(C-24)，33.1(C-25)，20.1(C-26)，19.8(C-27)，17.6(C-28)。以上数据与文献[26]报道基本一致，故鉴定为麦角甾醇。

化合物8无色针晶；5%硫酸乙醇显色为绿色；ESI-MS：m/z429.23 [M + H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：3.97(1H，m，H-3)，6.52(1H，d，J= 8.4 Hz，H-7)，6.26(1H，d，J= 8.4 Hz，H-6)，0.85(3H，s，H-18)，0.92(3H，s，H-19)，1.01(3H，d，J= 6.8 Hz，H-21)，5.23(1H，dd，J= 15.2，7.4 Hz，H-22)，5.17(1H，dd，J = 15.2，7.4 Hz，H-23)，0.86(3H，d，J= 7.0 Hz，H-27)，0.82(3H，d，J= 7.0 Hz，H-26)，0.94(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：34.9(C-1)，30.3(C-2)，66.7(C-3)，37.1(C-4)，82.3(C-5)，135.6(C-6)，129.9(C-7)，79.6(C-8)，51.2(C-9)，37.2(C-10)，23.6(C-11)，39.5(C-12)，44.7(C-13)，51.8(C-14)，28.9(C-15)，20.8(C-16)，56.4(C-17)，12.2(C-18)，18.4(C-19)，40.0(C-20)，21.0(C-21)，135.4(C-22)，132.5(C-23)，43.0(C-24)，33.3(C-25)，19.9(C-26)，20.2(C-27)，13.1(C-28)。以上数据与文献[27]报道基本一致，故鉴定为过氧麦角甾醇。

2.2 抗菌活性

抗菌活性实验结果表明，化合物1～6在100 μg/mL浓度时，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌均没有生长抑制活性。

2.3 抗肿瘤活性

2.3.1 MTT法检测化合物的体外细胞毒活性

采用MTT法考察了化合物1～6对人肿瘤细胞株SK-Hep-1、A549、HCT-116和MCF-7的体外细胞毒活性测试。结果表明，化合物2和4对所有测试的肿瘤细胞株均表现出细胞毒活性(见表1)，其中，化合物4对SK-Hep-1、A549、HCT-116和MCF-7这四个细胞株的IC50分别为3.10 ± 0.80、4.81 ± 1.01、8.25 ± 2.28、5.36 ± 1.29 μM，细胞毒活性均强于化合物2。

表1 化合物2和4对SK-Hep-1、A549、HCT-116和MCF-7细胞株的细胞毒活性Table 1 Cytotoxicity of compounds 2 and 4 against SK-Hep-1,A549,HCT-116 and MCF-7

2.3.2 流式细胞仪检测对细胞凋亡的影响

为进一步考察和比较化合物2和4对肿瘤细胞凋亡的影响，我们选取其中两株细胞株SK-Hep-1和A549进行了深入研究。结果如图2所示，化合物2在10 μM的浓度下对SK-Hep-1和A549细胞的凋亡率分别为22.77%、11.50%，被化合物2处理过的SK-Hep-1细胞主要集中于Q3区域，说明其主要是引起该细胞的早期凋亡；而在相同浓度处理下，化合物4相比于2具有更强的诱导凋亡作用，对SK-Hep-1和A549细胞的凋亡率分别为32.54%、17.83%，其中，对SK-Hep-1主要是引起细胞早期凋亡(25.6%)，诱导A549凋亡主要为晚期凋亡(10.3%)。

图2 化合物2和4对SK-Hep-1和A549细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of compounds 2 and 4 on apoptosis of SK-Hep-1 and A549 cells

3 讨论与结论

本文从一株绳生毛壳霉(C.funicolaCIB-604)的大米固态发酵物中分离得到了8个次级代谢产物，其结构类型包括3个异喹啉生物碱(1～3)和5个甾醇类化合物(4～8)，均首次从绳生毛壳霉中分离得到。化合物1～3是最早由本课题组从印度毛壳霉(C.indicum3.202)的次级代谢产物中发现的结构新颖的异喹啉生物碱[21]，迄今为止，绳生毛壳霉是第二种能够产生该类新颖异喹啉生物碱的真菌，推测绳生毛壳霉可能含有和印度毛壳霉相同的异喹啉生物碱生物合成途径。本论文对化合物1～6进行了抗菌活性和细胞毒活性测试，其抗菌活性结果表明在100 μg/mL的浓度时，化合物1～6对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌均没有表现出抑制效果；细胞毒活性结果表明化合物2和4对人肿瘤细胞SK-Hep-1、A549、HCT-116和MCF-7均显示出细胞毒活性，且化合物4对肿瘤细胞的抑制效果强于化合物2；流式细胞仪检测结果表明化合物2和4主要诱导SK-Hep-1细胞早期凋亡，而化合物2对A549细胞早期和晚期凋亡的影响差别不大，化合物4诱导A549细胞凋亡主要是晚期凋亡。本论文首次报道了化合物2对肿瘤细胞的细胞毒活性，分析结果可以发现，化合物3是2的差向异构体，但其细胞毒活性明显低于化合物2，说明羟基与异丙基之间的相对构型对其细胞毒活性有显著影响。与化合物5、6相比，4具有显著细胞毒活性，分析结构特征可以发现，化合物4的分子结构中有一个典型的活性中心——α，β-不饱和羰基结构单元，其能够与细胞中蛋白质的巯基发生烷基化反应，从而与肿瘤细胞结合并将其杀死[28]。综上所述，本论文对绳生毛壳霉CIB-604次级代谢产物及生物活性的研究结果为科学认识、合理开发利用该菌奠定了科学基础。