氟[18F]比他班自动化合成及初步临床应用

付华平，张晓军，常 燕，王 媛，张锦明

(中国人民解放军总医院第一医学中心 核医学科，北京 100853)

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease, AD)是进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性疾病[1]。据预测，到本世纪中叶，世界AD患者将增加至1.315亿[2]，而国际老年痴呆协会中国委员会数据显示，我国65岁以上老年人痴呆患病率为6.6%，且患病率每5年约增长一倍以上，80岁以上超过22%，到2050年，老年人口将增加到4亿，痴呆患者将接近2 000万，中国的痴呆人数将以336%的比例增长[3]。β淀粉样蛋白是AD特征性的病理改变之一，能够在AD早期反应疾病的发展。采用特异性结合Aβ的探针，PET显像可见AD患者脑内Aβ蛋白分布，借助计算机软件和生理数学模型进行定量分析，可以提高AD的早期诊断率。碳[11C]-PIB是一种较理想的Aβ显像剂，由于其亲脂性高，在脑内清除快，特异性强[4]，被称为评价AD的“金标准”，但由于11C的半衰期只有20 min，只适用于拥有医用回旋加速器的单位在线合成使用，每次合成仅够1～2例患者使用。目前，国内仅有几家医院具备生产和使用11C-PIB的条件，限制了其临床应用。18F-florbetaben用于疑似AD患者脑β-淀粉样蛋白的视觉检测，其灵敏度大于90%、特异性大于80%[5]，欧洲药品管理局(European Medicines Agency, EMA)于2013年批准该显像剂上市，美国FDA也于2014年批准Piramal Imaging公司氟[18F]比他班(商品名Neuraceq)上市，但是，针对该显像剂的进口生产模块功能单一、价格昂贵，目前国内尚未有医院采购该模块用于临床药物生产。本研究使用改良后的国产氟多功能合成模块自动化合成氟[18F]比他班(18F-florbetaben)，进行相应的质量控制，并初步进行18F-florbetaben的临床PET应用研究。

1 实验材料

1.1 试剂

氧[18O]水(H18O丰度大于97%)：江苏华益科技有限公司；合成试剂盒1、合成试剂盒2、纯化试剂盒(试剂盒清单见表1)：德国ABX公司。

表1 18F-florbetaben试剂盒清单Table 1 Reagents list of 18F-florbetaben

1.2 仪器

Sumitomo HM-20S回旋加速器：日本住友公司；PET-MF-2V-IT-Ⅰ型氟多功能合成模块：派特(北京)科技有限公司； 515 HPLC PUMP：美国Agilent公司；uMI 510 PET/CT扫描仪：上海联影公司；SLGV233RS无菌液体滤膜：美国Millpores公司；BQSV-A.B.P.T滤膜压力完整性测试仪：中国台湾BQSV公司；InSpector Radiation ALERT表面沾污仪：美国S.E.公司；CRC-15R，CRC-25R活度计：美国Capintec公司。

1.3 实验动物

正常雄性NIH小鼠5只，6～8周龄，(20±5) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2015.0001。

1.4 认知功能正常健康受试者及临床患者

该研究通过本院伦理委员会批准(S2018-166-01)。认知功能正常健康受试者均为通过临床查体和认知健康评估人员：女性两例(63和64岁)；阿尔兹海默病患者选自中国人民解放军总医院第一医学中心神经内科门诊患者，参照Petersen等诊断标准：男性一例(76岁)，女性一例(75岁)；认知功能正常健康受试者或患者家属均签署知情同意书。

2 实验方法

2.1 18F-florbetaben自动化制备

加速器经18O(p,n)18F反应得到18F-，由N2载带至QMA捕获，用0.6 mL洗脱液(含22 mg K2.2.2、7 mg K2CO3、0.3 mL乙腈、0.3 mL水)将QMA柱上18F-洗脱至反应瓶中，通入N2气流100 mL/min，115 ℃加热干燥4.5 min，再降低温度至85 ℃加热2 min保证除水完全；加入前体(7.0 mg叔丁氧羰-甲磺酸酯-二苯乙烯溶于1.8 mL乙腈)，120 ℃反应10 min；冷却后加入1.7 mL 2 mol/L盐酸，在110 ℃下水解5 min；加入5 mL中和溶液(含1.2 mL 2 mol/L NaOH、0.8 mL 1.0 mol/L甲酸铵、0.5 mL水、0.5 mL乙醇、2 mL乙腈)；混匀后利用HPLC分离，流动相为500 mL 60%乙醇水溶液(含0.16 g抗坏血酸、1.02 g抗坏血酸钠)，流速6 mL/min)，收集tR=7 min处产品峰，通过无菌滤膜至产品瓶(收集60 s，共计6 mL)，再将23 mL稀释基底液(含聚乙二醇400 5.2 mL、抗坏血酸0.15 g、抗坏血酸钠0.98 g、无水乙醇0.75 mL)通过无菌滤膜洗入产品瓶，共29 mL。合成路线示于图1。

图1 18F-florbetaben合成路线示意图Fig.1 Synthesis of 18F-florbetaben

2.2 18F-florbetaben的质量控制

目检18F-florbetaben注射液的性状：颜色及澄清度；使用精密pH试纸测量酸碱度；使用活度计检测产品的放射性活度；用半对数作图法估计半衰期；使用碘铂酸硅胶G薄层板检测产品中K2.2.2含量；使用分析型HPLC测量化学纯度和放化纯度[色谱柱为Atlantis T3，150 mm×4.6 mm，5 μm: Waters，紫外波长为320 nm，流动相A为磷酸盐缓冲溶液(含磷酸二氢钾680.5 mg、水1 050 mL和85%的磷酸溶液0.85 mL)，B为乙腈；流速为1.5 mL/min，线性梯度洗脱：0～5.5 min B/A为40/60(v/v)；5.5～5.6 min B/A为90/10(v/v)；5.6～10 min B/A为60/40(v/v)；气相色谱分析有机溶剂乙腈残留；凝胶法检测细菌内毒素；起泡点测试仪检测无菌滤膜的完整性。

2.3 小鼠毒性实验

取NIH小鼠5只，每只小鼠尾静脉注射0.1 mL 20 mCi/mL的18F-florbetaben注射液，正常饲养，48 h观察是否正常。

2.4 临床PET/CT显像

受试者按体质量静脉注射4.44 MBq/kg11C-PIB注射液并进行PET/CT显像；3 d后接受18F-florbetaben注射液，安静环境下休息90 min后行头部CT扫描，然后行PET图像采集，动态扫描20 min。CT重建采用标准重建法，利用CT数据对PET图像进行衰减校正；CT重建采用标准重建法，扫描参数：电压120 kV，电流100 mA，层厚5 mm；PET图像重建采用OSEM法，采用3D模式连续动态采集20 min，矩阵336×336，轴向视野为21.6 cm，以ROI技术勾画病变区域并计算SUVR。

3 结果与讨论

3.1 18F-florbetaben注射液的自动化制备

国产氟多功能模块置于符合GMP环境要求的热室内，18F-florbetaben注射液利用该模块自动化合成。整个合成包括除水、氟化亲核取代、脱保护基和半制备HPLC纯化，合成耗时约为38 min，不校正合成效率为(45.0±2.3)%(n=6)，合成稳定性和可靠性高。目前已合成30次，成功率100%，随机三批药物合成参数列于表2，分析型HPLC结果示于图2。

表2 三批次药物合成参数Table 2 Synthesis parameters of three batches of the drug

有不同工艺可用于合成18F-florbetaben：前体可为无保护基团的Stilbene-PEG-OMs或含保护基团的Boc-Stilbene-PEG-Oms，纯化方法可以采用半制备HPLC或Sep-pek C18小柱，有文献比较了不同前体和不同纯化方法生产18F-florbetaben的异同，结果显示以无保护基化合物为前体、使用C18柱纯化在时间和产率上均占优势，但C18小柱纯化无法实现前体的分离，产品中K2.2.2去除也不完全(虽然能通过半定量检测)[6]。本研究采用含有保护基团的前体Boc-Stilbene-PEG-Oms，半制备HPLC纯化，制备工艺严格按照美国FDA批准的18F-florbetaben制备工艺进行，该工艺使用一步除水，流动相流速为6 mL/min，在合成时间和效率方面都有明显优势。

3.2 18F-florbetaben注射液的质量控制

在铅玻璃下，产品为无色或淡黄色透明溶液，半衰期在105～115 min之间，γ能谱鉴定核素为18F，pH约为5.5；样品放射性峰与标准品紫外吸收峰相对保留时间一致，18F-florbetaben放化纯度大于95%，18F-florbetaben顺式异构体含量小于6%，其他化学杂质总含量小于10%；K2.2.2含量低于50 μg/mL；乙腈残留低于0.41 mg/mL，乙醇含量为12.4%；滤膜气泡点大于1.5 bar；细菌内毒素低于15 Eu/mL。使用当前18F-florbetaben合成工艺，有三个产品质控关键点：① 高活度下产品辐射分解；② 顺式异构体的放射化学含量；③ 含抗坏血酸(Vc)条件下K2.2.2测量。为了防止产品在高活度下辐射分解，除HPLC分离流动相内加入稳定剂抗坏血酸/抗坏血酸钠外，产品稀释基底液中也加入了抗坏血酸/抗坏血酸钠；18F-florbetaben在光照下会产生顺式异构体，为了减少其异构体的出现，自动化合成模块增加了光源控制按钮，在18F-传输完毕，关闭模块光源，同时将热室的光源关闭，产品合成过程为全自动，此时控制计算机软件即可完成产品合成与收集，最大程度减少了18F-florbetaben顺式异构体的出现；为了防止抗坏血酸对K2.2.2测量的干扰，对照品溶液均使用基质溶液(含107.2 mg抗坏血酸、701.6 mg抗坏血酸钠、16 mL水、4.4 mL聚乙二醇400和3.6 mL无水乙醇)配制。

a——18F-florbetaben的保留时间为4.228 min； b——标准品19F-florbetaben的保留时间为3.969 min 图2 分析型HPLC谱图Fig.2 HPLC spectrum of 18F-florbetaben

3.3 毒性实验

小鼠注射后48 h全部存活，未见异常毒性反应。

3.4 临床初步应用

临床PET/CT图像(图3)显示，认知功能正常志愿者18F-florbetaben和11C-PIB显像大脑形态如常，皮层各叶放射性分布未见明确浓聚，皮层下各神经核团显影清晰，放射性分布对称；而AD患者全脑18F-florbetaben SUVR为1.70，放射性分布增高、滞留，与11C-PIB基本一致。Senda等临床药理学研究结果显示，18F-florbetaben脑摄取迅速，从血中清除快，注射4 h后，血液中几乎检测不到放射性[7]。放射自显影法并经免疫组化染色等技术证实18F-florbetaben与AD患者大脑的β淀粉样蛋白斑块沉淀具有很高的结合力[8]，而且18F-florbetaben不与脑组织的tau蛋白或α-突触核蛋白结合，显示了它在诊断AD方面具有高的特异性[9]。有研究结果显示18F-florbetaben与AD显像剂“金标准”的11C-PIB的全脑SUVRs呈高度一致[10-11]。

图3 NC组和AD组PET/CT图像Fig.3 PET/CT images for NC and AD groups

4 小结

18F-florbetaben可以作为阿尔茨海默病诊断的一种理想显像剂。针对该药物进口合成模块的诸多局限，本研究提出使用改良的国产模块自动化合成18F-florbetaben，具有合成时间短、生产效率高等优势，可满足药物远距离配送的应用需求，使无法生产该显像剂的影像中心可以开展AD检查，使患者受益。