高效液相色谱-荧光检测器法同时测定小麦粉中L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸

马静 郝莉花 万梦飞 巩凡 李存良 赵喜梅

摘 要：建立了靈敏快速的高效液相色谱-荧光检测器法（High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detection，HPLC-FLD），检测小麦粉中L-抗坏血酸与D-异抗坏血酸含量。样品中的L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸采用偏磷酸-乙酸溶液提取，经活性炭催化脱氢后，与邻苯二胺衍生成具有强荧光性的物质。以20 mmoL/L磷酸氢二钠水溶液和乙腈体积比90︰10为流动相，经亲水性Waters T3 色谱柱分离，用配备荧光检测器的高效色谱仪进行测定。结果表明，L-抗坏血酸与D-异抗坏血酸在0.1～

10.0 μg/mL线性良好（R2≥0.999），检出限和定量限分别为0.7 mg/kg和2.0 mg/kg。以空白样品为基体，在2.22 mg/kg、22.20 mg/kg和222.00 mg/kg这3个浓度添加水平下进行加标回收实验，平均添加回收率为93.5%～101.0%，相对标准偏差≤1.73%（n=6）。该方法具有操作简便、灵敏度高、精密度好及准确性高的优点，成功用于市售11种小麦粉中L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸含量的测定。

关键词：小麦粉;L-抗坏血酸;D-异抗坏血酸;高效液相色谱-荧光检测器法（HPLC-FLD）

Simultaneous Determination of L-ascorbic Acid and D-isoascorbic Acid in Wheat Flour by High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detector

MA Jing， HAO Lihua*， WAN Mengfei， GONG Fan， LI Cunliang， ZHAO Ximei

（Henan Institute of Product Quality Supervision and Inspection， Zhengzhou 450000， China）

Abstract： A sensitive and rapid High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detector （HPLC-FLD） method was established to detect the content of L-ascorbic acid and D-isoascorbic acid in wheat flour. The L-ascorbic acid and D-isoascorbic acid in the sample were extracted with metaphosphoric acid-acetic acid solution， and then catalyzed dehydrogenation by activated carbon， and then derivatized with o-phenylenediamine into substances with strong fluorescence. Under the condition that the volume ratio of 20 mmoL/L disodium hydrogen phosphate aqueous solution and acetonitrile is 90∶10 as the mobile phase， it was separated on a hydrophilic Waters T3 chromatographic column， and measured with a high-performance chromatograph equipped with a fluorescence detector. The developed HPLC-FLD method exhibited good linearity （R2≥0.999） over the concentration range of 0.1～10.0 μg/mL， low limits of detection （LOD） and limits of quantification （LOQ） of 0.7 mg/kg and 2.0 mg/kg， respectively. The average recovery rate of L-ascorbic acid and D-isoascorbic acid under three addition levels of 2.22， 22.20， and 222.00 mg/kg ranged between 93.5%～101.0%， satisfactory precision with relative standard deviations ≤1.73%（n=6）. The method has the advantages of simple operation，high sensitivity，good precision and high accuracy， it has been successfully used for the determination of L-ascorbic acid and D-isoascorbic acid in 11 kinds of wheat flour on the market.

Keywords： wheat flour; L-ascorbic acid; D-isoascorbic acid; high performance liquid chromatography-

fluorescence detection（HPLC-FLD）

小麦粉作为北方居民的主食之一，含有丰富的膳食纤维、维生素、淀粉等各种营养成分，对人体健康有诸多益处[1]。但是，在过去十年中，突发性自然灾害或异常天气导致全球、区域和地方各级商业小麦的质量和产量出现了明显的停滞，引起国际小麦价格波动，给国民经济造成负担，影响粮食安全[2]。目前，国内加工业主要存在的问题是在某些生产年份，商品小麦生产的品质低于市场平均值，劣质小麦加工生产出来的小麦面粉质量不达标，可以通过化学、酶促或物理处理来改善[3]。

L-抗坏血酸，又称为维生素C，是一种天然存在的具有抗氧化性质的有机化合物，也是一种维持人体正常活动不可缺少的营养物质[4]。研究表明，在小麦粉中添加L-抗坏血酸可以保证面粉制作食物时的面筋蛋白含量，提高面团强度，降低面团黏性，因此被广泛用作面粉改良剂[5]。D-异抗坏血酸常作为抗氧化剂、防腐剂、发色助剂用于食品工业，但摄入过多也会使白细胞的抗病能力明显下降，会引起尿酸结石、腹泻、多尿及皮疹等。根据GB 2760—2014，小麦粉中允许使用L-抗坏血酸，最大使用量是0.2 g/kg，但不允许使用D-异抗坏血酸。然而，目前的研究主要集中在水果、蔬菜以及饮料中L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸总量的测定，且测定过程存在基质干扰以及L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸分离不佳的问题。对于小麦粉中L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸含量的测定鲜有报道。因此，建立一种高效，灵敏和可靠的方法分离并同时测定小麦粉中的L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸具有重要意义。

目前，抗坏血酸的测定方法比较多，有滴定法、电化学传感器法、荧光法和高效液相色谱法等。其中，滴定法操作简单、耗时短，但是不稳定，灵敏度低;电化学传感器法虽然具有直接、快速、选择性好和灵敏度高的特点，但是化学传感器的构建相对麻烦，且稳定性较差;高效液相色谱法由于操作简单、定量准确而被重视。本文采用高效液相色谱法，结合荧光检测器同时测定小麦粉中的L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的含量，采用偏磷酸-乙酸溶液提取，经活性炭催化脱氢后，与邻苯二胺衍生成具有强荧光性的物质，用配有荧光检测器的高效液相色谱仪测定，外标法定量，两者分离效果良好。该方法具有高效、灵敏、准确等特点，适用于小麦粉中L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的分离测定。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

乙腈（美国Honeywell公司，色谱级）;偏磷酸、冰乙酸和乙酸钠（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯）;十二水合磷酸氢二钠（天津市永大化学试剂有限公司，分析纯）;活性炭粉和邻苯二胺（上海Maklin有限公司，分析纯）;超纯水（自制）。

L-抗坏血酸（德国Dr.Ehrenstorfer公司，含量99.5%）;D-异抗坏血酸的（德国Dr.Ehrenstorfer公司，含量99.7%）。

1.2 仪器和设备

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）;ME-104E 电子分析天平（德国梅特勒-托利多公司）;V-14R 台式离心机（美国贝克曼公司）;QL 866 渦旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;一次性使用无菌注射器（河南曙光汇知康生物科技有限公司）;SB-25-12DT 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）;电子天平;涡旋混合器;台式离心机。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸标准储备溶液

（1 000 μg/mL）：分别称取L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸标准品10 mg（精确至0.1 mg），用偏磷酸-乙酸溶液定容至10 mL。将标准储备溶液逐级稀释至浓度为0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL及10.0 μg/mL的标准系列浓度。由于L-抗坏血酸对光不稳定，遇氧气易分解，需现用现配，避光保存。

1.3.2 样品前处理

（1）提取。称取小麦粉试样2.5 g（精确至0.01 g），加入25 mL偏磷酸-乙酸溶液，涡旋混合后，10 000 r/min离心5 min，移取上层液体，再加入20 mL偏磷酸-乙酸溶液，经相同方法处理后，合并两次提取液，并用偏磷酸-乙酸溶液定容至50 mL，混匀后待衍生化。

（2）衍生化。取上述提取液25 mL置于50 mL离心管中，加入活性炭粉1.0 g，剧烈摇动5 min，用定性滤纸过滤，取滤液1 mL置于10 mL离心管中，加入乙酸钠缓冲溶液1 mL，再加入2.5 mL邻苯二胺甲醇溶液，充分摇匀后，避光条件下放置

35 min后加入0.5 mL偏磷酸-乙酸溶液，混匀后过0.22 μm微孔滤膜后，供高效液相色谱-荧光检测器法（High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detection，HPLC-FLD）测定。

同时做空白试验，除不加试样外，其余按照1.3.2样品前处理步骤进行操作。

1.3.3 色谱条件

使用Waters T3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）对L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸进行分离;使用荧光检测器，在激发波长346 nm，发射波长428 nm的条件下进行测定。柱温40 ℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。流动相：20 mmoL/L的Na2HPO4水溶液，乙腈（90︰10，v︰v）。

1.3.4 分析方法

样品经过1.3.2样品前处理后采用液相色谱分析并计算抗坏血酸和异抗坏血酸的峰面积，液相色谱分析抗坏血酸和异抗坏血酸标准系列，并分别根据标准系列中抗坏血酸和异抗坏血酸浓度为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，建立标准曲线，样品峰面积代入到标准曲线中外标法计算上机液中抗坏血酸和异抗坏血酸含量，按公式（1）计算样品中抗坏血酸和异抗坏血酸含量。

式中：X为样品中抗坏血酸和异抗坏血酸含量，mg/kg;C为上机液中抗坏血酸和异抗坏血酸的含量，μg/mL;C0为空白样液中抗坏血酸和异抗坏血酸的含量，μg/mL;V为上机液最终定容体积，mL;m为样品的质量，g。

2 结果与分析

2.1 流动相的优化

通过改变流动相中水相和有机相乙腈的比例，研究了不同比例流动相条件下L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的理论塔板数和分离度，结合两者的保留时间，确定了L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸检测的最佳流动相比例。流动相比例与分析结果见表1，从表1中可以发现当20 mmoL/L的Na2HPO4水溶液的比例达到90%的时候，L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸可以得到有效的分离，分离度R为3.61;继续增大水相比例，分离度和理论塔板数继续增加，但是保留时间也会进一步延长，增加了时间成本。故综合考虑分离效果、检测灵敏度和时间，最后选择

20 mmoL/L的Na2HPO4的水溶液和乙腈体积比90︰10作为HPLC-FLD检测的流动相。

2.2 色谱柱的选择

考察了3种色谱柱Waters T3、Eclipse Plus C18、InertSustain C18的分离效果，结果表明，3种色谱柱对L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸标准样品分离的峰形良好，定量无干扰，均能满足检测要求。综合考虑分离度、响应值、保留时间以及噪声，最后选择Waters T3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），标准样品浓度为0.5 μg/mL的色谱图如图1所示。

2.3 线性范围

准确移取L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸标准系列浓度各25 mL，余下按照1.3.2 样品前处理中衍生化步骤操作。衍生后的标准系列溶液按照浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，绘制标准曲线，结果表明，L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸在0.1～

10.0 μg/mL线性关系良好。L-抗坏血酸的线性回归方程：Y=5.443 042 59X-0.194 738 4，R2=0.999 98;

D-异抗坏血酸的线性回归方程：Y=4.920 889 41X-0.400 512 4，R2=0.999 86。

2.4 加标回收实验

为了确定方法的回收率，选择不含有L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的小麦粉做空白基质，用L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸标准品分别以2.22 mg/kg、22.20 mg/kg、222.00 mg/kg 3个浓度加标小麦粉样品，每个浓度水平设置6个平行。结果如表2所示，L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸在小麦粉中的平均回收率分别为96.5%～99.1%和97.8%～101.0%，相对标准偏差分别为1.07%～1.73%和1.43%～1.50%。

2.5 市售样品测定

采用本方法对市售11种小麦粉中的L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸进行测定，准确性好，灵敏度高。其中有4批次小麦粉中的L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸均未检测出;有5批次小麦粉检测出L-抗坏血酸，都在国标允许添加的范围内;有7批次小麦粉检测出D-异抗坏血酸。结果表明，有些小麦粉中确实存在D-异抗坏血酸，应当引起相关监管部门及生产企业的重视，加强监管。

3 结语

本文建立的小麦粉中L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的高效液相色谱-荧光检测器分析检测方法，使用Waters T3色谱柱可以有效实现两种物质的分离，灵敏度高，精密度好，回收率高，且成功应用于市售11种小麦粉中L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的分离测定。

参考文献

[1]杜世超.收获期降雨对春小麦穗发芽和产量品质的影响[D].哈尔滨：黑龙江八一农垦大学，2021.

[2]Kim M J， Kim S S. Determination of the optimum mixture of transglutaminase， l-ascorbic acid and xylanase for the quality and consumer acceptability of bread using response surface methodology[J]. Food science and biotechnology， 2016，25（1）：77-84.

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[4]張清，李刚.高压液相色谱法同时测定食品中抗坏血酸与异抗坏血酸的含量[J].食品安全质量检测学报，2013，4（1）：251-256.

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